Экспериментальное обоснование механизмов действия MesoEye С71™

В.В. Ашапкин, к.б.н., с.н.с., НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Л.И. Кутуева, м.н.с., НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Б.Ф. Ванюшин, д.б.н., профессор, член-корр. РАН, заведующий отделом, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Стимуляция дренажной активности лимфатической системы

Введение
Помимо общих изменений кожи, обусловленных хронологическим и внешним старением, существует проблема, свойственная индивидам обоих полов и самого разного возраста – темные круги и мешки под глазами. К сожалению, ухудшение эластических свойств кожи и аномалии отложения липидов с возрастом усугубляют и эту проблему. Вполне очевидно, с другой стороны, что она ухудшается не только с возрастом, но и при состояниях общей усталости, например при недостатке сна. Очевидно, темные круги и мешки под глазами являются не только возрастной, но и, в значительной степени, физиологической проблемой. Замечено, что эта проблема более характерна для определенных этнических групп, а также часто наблюдается у разных членов одной и той же семьи. Это наводит на мысль, что существуют генетически обусловленные особенности, влияющие на степень ее выраженности у конкретных индивидов. Гистологические исследования показывают, что непосредственные причины темных кругов и мешков под глазами весьма разнообразны. Среди наиболее типичных – отложения меланина, гиперпигментация после атопического или аллергического дерматита, поверхностное расположение сосудов, сниженный тонус кожи, вирусные и паразитарные инфекции, заболевания щитовидной железы [1, 2]. Частой причиной отеков является недостаточная дренажная активность лимфатической системы. 

Накопление жидкости в межуточном (интерстициальном) пространстве периферических тканей является результатом ультрафильтрации плазмы крови с содержащимися в ней молекулами через эндотелиальный слой артериальной и венозной капиллярной сети [3]. Движущей силой этого процесса является баланс гидростатического и осмотического давлений между внутренним пространством микрососудов кровеносной системы и межуточным пространством окружающей ткани. Обратный захват межуточной жидкости (МЖ) и ее возвращение в кровеносную систему осуществляет главным образом лимфатическая система. Вместе с плазмой в межуточное пространство выходят также белки и малые молекулы. Специальный матрикс из гликопротеинов и гликозаминогликанов (гликокаликс) на внутренней поверхности эндотелиальных клеток (ЭК) и между ними играет роль своеобразного сита с вариабельным размером пор, регулируя скорость фильтрации и состав МЖ. После захвата капиллярами лимфатической системы МЖ становится лимфой. Состав лимфы в значительной степени зависит от периферической ткани, в которой она формируется. В нее попадают продукты процессинга компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), роста и ремоделирования ткани, катаболизма клеток, обломки гибнущих клеток, тканеспецифические белки и другие молекулы.

Лимфатическая система состоит из первичных (капилляров) и вторичных (собирающих) лимфатических сосудов (ЛС), лимфатических узлов (ЛУ) и ассоциированных с ними лимфоидных органов [4]. В отличие от кровеносной системы, она является незамкнутой и обеспечивает поглощение МЖ, иммунных клеток и макромолекул капиллярами и их однонаправленный транспорт через собирающие ЛС к ЛУ, а от них – в кровеносное русло (рис.1). В каждый ЛУ впадает несколько афферентных сосудов, а выходит один более крупный, эфферентный. В конце концов, лимфа попадает в грудной лимфатический проток и правый лимфатический ствол, а из них, через специальные лимфовенозные клапаны рядом с местом впадения внутренней и внешней яремных вен, в подключичную вену. Лимфовенозные клапаны предотвращают проникновение крови из вен в ЛС. Главными функциями лимфатической системы являются регуляция жидкостного гомеостаза тканей и движение клеток иммунной системы. В тонком кишечнике лимфатические капилляры выполняют особую функцию – поглощение и транспорт хиломикронов, выделяемых клетками кишечного эпителия. Основные успехи в исследовании лимфатической системы связаны с идентификацией специфических для лимфатических эндотелиальных клеток (ЛЭК) молекулярных маркеров. Наиболее важные из них: рецептор васкулярных эндотелиальных факторов роста VEGFR3 (vascular endothelial growth factor receptor 3), фактор транскрипции PROX1 (prospero homeobox 1), мембранный гликопротеин PDPN (podoplanin) и лимфатический эндотелиальный рецептор гиалуроновой кислоты (ГК) LYVE1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1).
 
 
Рис. 1. Организация лимфатической системы. А – однонаправленное движение лимфы от лимфатических капилляров (1) через собирающие сосуды (2) и лимфоузлы (3) в грудной лимфатический проток и правый лимфатический ствол (4), впадающие в подключичную вену. Б – лимфатические капилляры поглощают межуточную жидкость (МЖ), макромолекулы и иммунные клетки, выходящие из кровеносных капилляров, через «откидные клапаны» в промежутках между прерывистыми межклеточными контактами. В – в собирающих лимфатических сосудах (ЛС) эндотелиальные клетки соединены непрерывными контактами, содержат двустворчатые клапаны и имеют оболочку из гладкомышечных клеток (ГМК). Г – в лимфатический узел входит несколько афферентных ЛС, а выходит один эфферентный ЛС (направление движения лимфы указано стрелками). Д – лимфа достигает венозной системы через специальные лимфовенозные клапаны (стрелки), расположенные рядом с местами впадения внешней и внутренней яремных вен (ЯВ) в подключичную вену (ПКВ).

Лимфатические капилляры образуются монослоем ЭК, имеющих форму дубового листа и лежащих на неплотной базальной мембране (БМ), и не содержат поддерживающего слоя гладкомышечных клеток (ГМК) (рис.2). Контакты между соседними ЛЭК в капиллярах имеют прерывистый («пуговичный») характер [5]. При повышении давления МЖ происходит натяжение якорных филаментов, соединяющих зоны межклеточных контактов с волокнами ВКМ. В результате перекрывающиеся участки соседних ЛЭК между контактами оттягиваются друг от друга и обеспечивают более активный вход МЖ и иммунных клеток в лимфатическое русло. Таким образом, проницаемость капилляров автоматически регулируется в соответствии с потребностью в их дренажной активности.   

 
Рис. 2. Особенности структурной организации различных ЛС. Лимфатические капилляры не содержат сплошной оболочки из БМ и ГМК и состоят из монослоя ЛЭК, имеющих форму дубового листа и соединенных прерывистыми межклеточными контактами, промежутки между которыми играют роль «откидных» клапанов для входа жидкости, макромолекул и иммунных клеток из межуточного пространства. Зоны межклеточных контактов соединяются с волокнами внеклеточного матрикса специальными якорными филаментами. Собирающие ЛС имеют оболочку из БМ и ГМК, состоят из ЛЭК удлиненной формы, соединенных сплошными межклеточными контактами, и содержат люминальные двустворчатые клапаны, обеспечивающие однонаправленный ток лимфы. Участок сосуда между соседними клапанами называется лимфангионом (lymphangion).

Лимфатические капилляры сливаются в более крупные собирающие сосуды. Последние образуются монослоем ЭК, лежащим на сплошной БМ и поддерживающей оболочке из мышечных клеток, фибробластов и соединительной ткани. В собирающих ЛС ЭК имеют вытянутую форму, а контакты между ними непрерывные (zipper-like junctions), что предотвращает вытекание лимфы. Мышечные клетки, сочетающие свойства гладкой и скелетной мускулатуры, обеспечивают тонус и периодические сокращения ЛС, стимулирующие центростремительное движение лимфы. В просвете собирающих ЛС присутствуют двустворчатые клапаны, которые открываются синхронно с их сокращениями. Клапаны состоят из соединительной ткани, покрытой специализированными ЛЭК. Скорость течения лимфы может заметно изменяться при патологических состояниях, способствующих усиленному лимфангиогенезу, движению клеток, увеличению объема и тока лимфы, увеличению продукции медиаторов воспаления, влияющих на сократимость лимфатических сосудов. 
Исследования врожденных нарушений жидкостного гомеостаза и других функций лимфатической системы показали, что в их основе чаще всего лежат дефекты генов, кодирующих функционально важные белки ЛЭК [6-9]. Очевидно, функциональная активность лимфатической системы и зависящие от нее состояния тканей определяются экспрессией этих генов. Поэтому мы исследовали эффекты препарата MesoEye™ C71 на уровни экспрессии генов, кодирующих функционально важные белки эндотелиальных клеток. 

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали культивируемые эндотелиальные клетки HMVEC-D (human dermal microvascular endothelial cells), полученные из микрососудов кожи человека и представляющие собой смесь эндотелиальных клеток кровеносных и лимфатических сосудов (компания Lonza, CC-2543). После размораживания клетки культивировали на среде EGM-2 MV BulletKit (Lonza CC-3202) при температуре 37оC в увлажненной атмосфере 5% CO2 в пластиковых чашках Петри в течение 2 пассажей. Для оценки влияния MesoEye™ C71 на клетки его добавляли к среде (10 мкл на 1 мл среды) перед началом третьего пассажа и выращивали клетки до формирования монослоя. Контрольные клетки выращивали аналогично, но без добавления препарата. По окончании третьего пассажа среду удаляли, а к клеткам добавляли реагент, стабилизирующий РНК, RNAprotect Cell Reagent (Qiagen, Германия). После открепления клеток от поверхности чашек Петри под действием реагента образующуюся суспензию переносили в стерильные пластиковые микропробирки и хранили несколько суток в холодильнике до выделения РНК.

Выделение и очистку суммарной РНК из клеток осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем набора. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой цепи кДНК с помощью набора обратной транскрипции Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США) по рекомендованной производителем прописи. В качестве матрицы на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл использовали 200 нг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для ПЦР из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР с флуоресцентно мечеными гибридизационными зондами (TaqMan qPCR) проводили с помощью набора qPCRmix-HS (Евроген, Россия) и термоциклера ДТ-322 (ДНК Технология, Россия). В качестве внутреннего стандарта использовали референсный ген GAPDH. Концентрацию его транскриптов измеряли в тех же самых ПЦР смесях, используя гибридизационный зонд меченый другой флуоресцентной меткой: динамику амплификации кДНК для исследуемых генов измеряли по росту флуоресценции в канале Fam, а динамику амплификации кДНК для референсного гена – в канале Hex. Уровень экспрессии каждого гена измеряли в трех параллельных экспериментах на независимо полученных образцах клеток (биологические параллели). Для каждого образца проводили минимум три параллельные ПЦР в соседних лунках прибора (технические параллели). Полученные данные импортировали в программу Microsoft Exel 2003 и обрабатывали статистически, принимая концентрацию мРНК референсного гена во всех образцах за 1. Конструирование олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для количественной ПЦР осуществляли с помощью онлайн-сервиса IDT PrimerQuest https://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index , а их синтез – в компании Синтол (Россия).

Результаты и их обсуждение
 Развитие и базовая функциональная активность лимфатической системы

На первом этапе мы исследовали эффекты MesoEye C71™ на экспрессию генов, детерминирующих развитие и фенотипические свойства ЛЭК. Главными функциями лимфатической системы являются участие в иммунных ответах и обратный захват жидкости, белков и клеток из тканей для их возвращения в кровеносное русло.
В ходе эмбрионального развития лимфатическая система образуется из ЭК кардинальной вены. Этот процесс запускается гетеродимером факторов транскрипции NR2F2 и PROX1. Одним из главных молекулярных маркеров ЛЭК у взрослых млекопитающих является VEGFR3 (также известный как FLT4) – рецепторная тирозин-киназа, активируемая васкулярными эндотелиальными факторами роста VEGFC и VEGFD [10]. Во время раннего эмбриогенеза ген VEGFR3 экспрессируется в кровеносных сосудах, а в позднем эмбриогенезе и постнатально – только в лимфатических (рис. 3). Как показано на рисунке 3, добавление MesoEye™ C71 многократно (в 6,5 раз) увеличивает экспрессию гена VEGFR3. В ходе эмбрионального развития ЛС начинают формироваться после начала кровообращения, у человека на 6-7 неделе, у мыши на 9-10 день (E9,5-10). В субпопуляции ЭК общей кардинальной вены индуцируется экспрессия гомеобокс-содержащего фактора транскрипции PROX1. Это и служит первичным сигналом детерминации развития этих клеток по лимфатическому пути. 

Рис. 3. Этапы развития лимфатической системы и контролирующие их гены (в скобках – дни эмбрионального развития у мыши). КВ – кардинальная вена; пЛЭК – первичные ЛЭК; пПЛС – периферический продольный лимфатический сосуд; пГП – первичный грудной проток. Красными плюсами показаны гены, экспрессия которых стимулируется MesoEye C71: + – в 1,5-2 раза,  ++ – в 2-5 раз, +++ – в >5 раз. 

У мыши к E10,5 первичные ЛЭК покидают вены и мигрируют в виде слабо скрепленных групп, которые впоследствии сливаются в первичные лимфатические структуры (лимфатические мешки). Яремные лимфатические мешки состоят из двух сосудов – первичного грудного протока и периферического продольного лимфатического сосуда. Клетки, соединяющие первичный грудной проток и кардинальную вену, сливаются в лимфовенозные клапаны, предотвращающие попадание крови в лимфатическую систему. Большая часть периферической лимфатической сосудистой сети развивается центробежно из лимфатических мешков путем лимфангиогенеза, то есть образования новых сосудов путем ветвления уже существующих. Однако некоторые ЛЭК вначале существуют как обособленные группы клеток, отделенные от участвующих в лимфангиогенезе. Сливаясь, они образуют новые сосуды, которые затем соединяются с основной лимфатической сетью (механизм лимфоваскулогенеза). Рецептор ГК LYVE1 участвует в процессах адгезии и межклеточного взаимодействия, и узнает не только ГК, но и другие компоненты ВКМ, такие как остеопонтин, коллагены и металлопротеиназы. При добавлении MesoEye C71™ уровень экспрессии гена LYVE1 повышается в 2 раза. Еще одним специфическим маркером ЛЭК является трансмембранный гликопротеин муцинового типа подопланин (PDPN). Нуль-мутации по гену PDPN приводят к лимфатическим отекам, расширению ЛС и общему ухудшению дренажной функции лимфатической системы. Уровень экспрессии гена PDPN при добавлении MesoEye C71™ увеличивается в 5,7 раз. Фактор транскрипции PROX1 считается мастер-регулятором лимфатического фенотипа [11, 12]. Нуль-мутации по гену PROX1 у мыши приводят к тому, что ЭК отпочковываются от кардинальной вены, но не пролиферируют и не дифференцируются в ЛЭК. Суперэкспрессия PROX1 в ЭК кровеносных сосудов, напротив, индуцирует экспрессию специфических для ЛЭК маркеров. Для поддержания идентичности ЛЭК необходима постоянная экспрессия PROX1, в противном случае происходит их обратное превращение в венозные ЭК. Возможно, такая пластичность необходима для гибкой адаптации сосудистой системы к изменяющимся условиям. Добавление MesoEye C71™  умеренно (в 2,7 раза) стимулирует экспрессию PROX1. Природа сигналов, индуцирующих начало экспрессии PROX1 в части ЭК кардинальной вены, не до конца выяснена. Для специализации ЛЭК необходима экспрессия фактора транскрипции SOX18 до начала экспрессии PROX1. Он узнает участок промотора гена PROX1 и непосредственно стимулирует его активность. Для индукции экспрессии PROX1 необходим также фактор транскрипции NR2F2. Важным механизмом его действия является индукция корецептора VEGFC, NRP2 [13]. Мутации по гену NRP2 приводят к гипоплазии лимфатических капилляров, но не влияют на развитие кровеносных сосудов. Отпочкование ЛЭК от лимфатических мешков абсолютно зависимо от сосудистого фактора роста VEGFC: у VEGFC-дефицитных мышей ЛС не образуются вовсе. Добавление MesoEye C71™  приводит к умеренному повышению уровней экспрессии генов NR2F2 (в 3 раза) и NRP2 (в 3,3 раза), но практически не влияет на активность генов SOX18 и VEGFC. 

Мутация по гену белка CCBE1 (collagen and calcium binding EGF domains 1) является причиной синдрома Хеннеками – одной из форм первичной лимфедемы. Ген CCBE1 экспрессируется в области развивающихся ЛС и в развивающемся сердце эмбрионов. У мышей, дефектных по CCBE1, нарушено отпочкование первичных ЛЭК от кардинальной вены, и первичные лимфатические мешки не образуются. CCBE1 связывается с определенными белками ВКМ и повышает активность сигнального пути VEGFR3, стимулируя расщепление VEGFC до полностью зрелой активной формы металлопротеазой ADAMTS3 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 3). Дефектные по ADAMTS3 мышиные эмбрионы не имеют периферической лимфатической сосудистой сети, и погибают после E15 вследствие глобального отека тканей. Добавление MesoEye™ C71 приводит к небольшой (в 1,8 раза) стимуляции экспрессии CCBE1, но не влияет на экспрессию ADAMTS3.

После образования первичного лимфатического сплетения происходит созревание лимфатической сети, включающее формирование иерархического древа из лимфатических капилляров, преколлекторов и собирающих сосудов. В собирающих ЛС происходит образование клапанов, рекрутирование ГМК и формирование БМ. Между E17,5 и P28 в лимфатических капиллярах  происходит переход от сплошных межклеточных контактов к прерывистым. Существенную роль в этом переходе играет сигнальный путь ангиопоэтина 2 (ANGPT2). Добавление MesoEye C71™  умеренно (в 2 раза) стимулирует экспрессию гена ANGPT2. В созревании собирающих ЛС участвует несколько сигнальных путей. Первый из них, FOXC2/CNB1/NFATC1, необходим не только для созревания собирающих ЛС и образования клапанов, но и для поддержания их целостности в постнатальный период. FOXC2 действует кооперативно с CNB1/NFATC1. Другие молекулы, участвующие в этом процессе, это – белки щелевых контактов коннексины CX26, CX37, и CX43, RELN (reelin), EMILIN1 (elastin microfibril interfacer 1), SEMA3A, NRP1, EFNB2/EPHB4 (ephrin-B2/EPH receptor B4), GDF2 (growth differentiation factor 2), ALK1 (activin A receptor type 1), TGFBR2 (transforming growth factor β receptor 2), и GATA2 (GATA binding protein 2). Добавление MesoEye C71™  умеренно стимулирует экспрессию генов FOXC2 (в 2,7 раза), SEMA3A (в 3 раза) и EFNB2 (в 2,2 раза), слабо стимулирует экспрессию генов NFATC1 (в 1,8 раза), RELN (в 1,5 раза) и EPHB4 (в 1,5 раза) и не влияет на активность остальных генов. 

Независимо от конкретной причины, при недостаточно активном оттоке лимфы (лимфостазе) происходит накопление жидкости в межуточном пространстве и опухание соответствующих участков тела [14]. Когда лимфостаз носит хронический характер, наблюдается разная степень кожного и подкожного фиброза и, часто, значительные отложения подкожного жира. В сумме эти паталогические явления обозначаются как лимфедема. Она может возникать также в результате нарушений пролиферации лимфатических микрососудов. Последнее может приводить к различным метаболическим нарушениям, а также местным и системным нарушениям активности иммунной системы. Течение жидкости по ЛС обеспечивается несколькими силами. В случае сосудов в скелетных мышцах - компрессией со стороны окружающих мышц: благодаря наличию клапанов, она обеспечивает проталкивание лимфы в центральном направлении. В других тканях, таких как внутренние органы или кожные покровы, главной движущей силой являются сокращения ГМК самих ЛС. Они усиливаются по частоте и амплитуде при повышенном давлении в сосудах под действием симпатической нервной системы, гормонов и простаноидов. Нарушения достаточного движения лимфы приводят к лимфедеме. Отек развивается, когда продукция МЖ превышает ее отток. При определенных условиях продукция МЖ может увеличиться в 10-20 раз, что превышает возможности лимфотока и вызывает выраженный отек. 

 Мутации гена VEGFR3 у человека являются одной из наиболее частых причин наследственных лимфатических отеков (лимфедем) [9]. Главный лиганд VEGFR3 в лимфатических сосудах, VEGFC, стимулирует пролиферацию и выживание ЛЭК в условиях клеточной культуры. В модели контактной хронической гиперчувствительности у мышей аденовирусная экспрессия VEGFC уменьшала признаки хронического воспаления (увеличенные лимфатические  сосуды, отек, инфильтрация макрофагов), а экспрессия антител к VEGFR3 – наоборот, усугубляла их [15]. Очевидно, VEGFR3-зависимая активность VEGFC приводит к разрешению воспаления, усиливая дренажную активность ЛС. Как уже отмечалось выше, добавление MesoEye C71™  сильно (в 6,5 раз) стимулирует уровень экспрессии гена VEGFR3 и не влияет на экспрессию гена VEGFC. В целом это свидетельствует об усилении дренажной активности ЛС под действием препарата. 

Клапаны и проницаемость лимфатических сосудов
К врожденным лимфатическим отекам, фиброзу конечностей и повышенной чувствительности к инфекциям приводят и дефекты образования двустворчатых клапанов в собирающих ЛС [16]. Лимфатические клапаны образуются из специализированных ЛЭК, экспрессирующих гены факторов транскрипции PROX1,  FOXC2 и GATA2. FOXC2 отвечает за позиционирование и спецификацию клапанов: его утрата приводит к отсутствию клапанов и аномальному току лимфы. Мутации FOXC2 у человека приводят к лимфедеме и дистихиазу (двойному ряду ресниц). Как уже отмечалось, при действии MesoEye™ C71 экспрессия генов PROX1 и FOXC2 увеличивается примерно в 2,7 раза. На активность гена GATA2 препарат не влияет. После спецификации клетки лимфатических клапанов отделяются от стенки сосуда, вытягиваются и мигрируют в просвет сосуда, формируя сердцевидные пластинки, препятствующие обратному току лимфы (рис. 4). 

Рис. 4. Морфогенез двустворчатых клапанов в собирающих лимфатических сосудах. Группы ЛЭК, экспрессирующих на высоком уровне факторы транскрипции PROX1, FOXC2 и GATA2, обособляются в участках бифуркаций и возмущенного лимфотока (белые пунктирные стрелки). Участок будущего клапана устанавливается индукцией экспрессии белка щелевых контактов (gap junctions) коннексина 37 (CX37), активацией сигнального пути CNB1/NFATC1, переориентацией ЛЭК и накоплением ламинина α5 (LAMA5) во ВКМ. Створки клапана образуют кольцевую структуру в результате взаимодействия интегрина α9 (ITGA9) с фибронектином (FN1) и активации сигнального пути SEMA3A/NRP1/PLXNA1. Затем происходит инвагинация, образование сквозного протока и элонгация створок клапана: образуется зрелый клапан, состоящий из двух двуслойных створок. Каждая из створок содержит плотную сердцевину ВКМ (FN1; показана темно-оранжевым цветом). Лимфоток становится однонаправленным (сплошные белые стрелки). Взаимодействие ЛЭК клапанов, через экспрессируемый в них лиганд SEMA3A, с ГМК, экспрессирующими рецептор NRP1, приводит к их взаимному отталкиванию, тем самым поддерживая область клапана в свободном от ГМК состоянии. Постоянная активность сигнальных путей CNB1/NFATC1 и EFNB2 важна для поддержания стабильного фенотипа ЛЭК створок клапана. Эти ЛЭК имеет особый молекулярный профиль (показан в прямоугольнике). Красными плюсами показаны гены, экспрессия которых стимулируется MesoEye C71: + – в 1,5-2 раза,  ++ – в 2-5 раз.

Для вытягивания ЛЭК будущего клапана необходимо взаимодействие мембранного рецептора интегрина α9 (ITGΑ9) с его лигандом во ВКМ, фибронектином (FN1). Существенную роль в образовании лимфатических клапанов играет ген SEMA3A, кодирующий секретируемый белок семейства семафоринов. Экспрессия генов ITGA9 и SEMA3A под действием MesoEye C71™  увеличивается в 1,5 и 3 раза, соответственно, а экспрессия гена FN1 не изменяется. Важную роль в образование клапанов в собирающих ЛС играет трансмембранный лиганд EFNB2. Связываясь с рецепторной тирозин-киназой EPHB4, он запускает сигнальный каскад, приводящий к взаимному отталкиванию EFNB2-экспрессирующих и EPHB4-экспрессирующих клеток. Через особый C-концевой PDZ-связывающий мотив EFNB2 также генерирует «обратный» сигнал, необходимый для ветвления (ангиогенеза) ЛС. В собирающих ЛС ген EFNB2 сильно экспрессируется в клетках двустворчатых клапанов. У мутантных мышей, не имеющих PDZ-связывающего мотива EFNB2, клапаны в ЛС отсутствуют. Индуцибельная делеция гена EFNB2 в зрелых ЛС приводит к уменьшению числа клапанов и их деформации. Очевидно, обратный сигналинг EFNB2 необходим как для образования клапанов, так и для их стабильного поддержания в уже сформировавшихся ЛС. Во внутреннем пространстве лимфатических капилляров клапаны отсутствуют. Интересным исключением являются лимфатические капилляры роговицы, в которых обнаружены микроклапаны [17]. В этих капиллярах ЛЭК клапанов активно экспрессируют ген EPHB4, а окружающие ЛЭК - ген EFNB2. Нарушение активности сигнального пути EFNB2– EPHB4 препятствует образованию и поддержанию клапанов. При добавлении MesoEye™ C71 уровни экспрессии генов EFNB2 и EPHB4 увеличиваются в 2,2 и 1,5 раза, соответственно. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что формирование клапанов в ЛС и их дальнейшее поддержание в присутствии MesoEye C71™  более эффективны. Это, несомненно, должно улучшать дренажную функцию ЛС.

Проницаемость эндотелия ЛС в значительной степени определяется экспрессией ангиопоэтина 2 (ANGPT2). При дефиците ANGPT2 в лимфатических капиллярах нарушается преобразование межклеточных контактов из сплошных в прерывистые [18]. Тем самым затрудняется захват жидкости и других компонентов лимфы из межуточного пространства. В собирающих ЛС при этом нарушается структура адгезионных контактов и формирование клапанов. Это приводит к «подтеканию» собирающих ЛС и нарушению нормального тока лимфы. В целом недостаточно активная экспрессия ANGPT2 сильно нарушает основную дренажную функцию лимфатической системы. Экспрессия гена ANGPT2 под действием MesoEye C71™  увеличивается в 2 раза. Важную роль в регуляции проницаемости лимфатического эндотелия играют также молекулы десмоплакина, цитоплазматического якорного белка, связывающего средние филаменты с клеточной мембраной. При добавлении MesoEye C71™  уровень экспрессии гена десмоплакина (DSP)  возрастает на порядок (в ~10 раз). Это свидетельствует о стабилизации эндотелия ЛС и уменьшении проницаемость их стенок. В то же время, это не должно ухудшать дренажную функцию лимфатических капилляров, поскольку захват жидкости и других компонентов лимфы из межуточного пространства происходит через межклеточные участки, свободные от адгезионных и плотных контактов. В сумме перечисленные эффекты MesoEye C71™  должны кардинально улучшать целостность ЛС и усиливать их дренажную активность.

Заключение
MesoEye C71™  стимулирует функциональную активность лимфатической системы в целом и дренажную функцию ЛС в частности, благодаря усилению экспрессии генов VEGFR3 (рецептора васкулярного эндотелиального фактора роста C), NRP2 (его корецептора), PROX1 (мастер-регулятора фенотипа лимфатических эндотелиальных клеток), NR2F2 (важного фактора венозного и лимфатического ангиогенеза), LYVE1 (специфического для ЛЭК рецептора ГК) и PDPN (специфического для ЛЭК трансмембранного гликопротеина).
Улучшению дренажной функции ЛС способствует активация под действием препарата экспрессии генов, ответственных за формирование и поддержание двустворчатых клапанов в ЛС (PROX1, FOXC2, ITGA9, EFNB2 и EPHB4), а также стимуляция экспрессии генов десмоплакина (DSP) и ангиопоэтина 2 (ANGPT2), стабилизирующих стенки ЛС.

Список литературы
1.    Freitag F.M. & Cestari T.F. What causes dark circles under the eyes? J Cosmet Dermatol. 2007; 6: 211–215.
2.    Sobel R.K., Carter K.D., & Allen R.C. Periorbital edema: a puzzle no more? Curr Opin Ophthalmol. 2012; 23: 405–414.
3.    Hansen K.C., Alessandro A.D., Clement C.C., & Santambrogio L. Lymph formation, composition and circulation: a proteomics perspective. Internat Immunol. 2015; 27: 219–227.
4.    Aspelund A., Robciuc M.R., Karaman S., Makinen T., & Alitalo K. Lymphatic system in cardiovascular medicine. Circ Res. 2016; 118: 515-530.
5.    Baluk P., Fuxe J., Hashizume H., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 2007; 204: 2349-2362.
6.    Ferrell R.E., Kimak M.A., Lawrence E.C., & Finegold D.N. Candidate gene analysis in primary lymphedema. Lymphatic Res Biol. 2008; 6: 69-76.
7.    Ji R.-C. Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation. Lymphatic Res Biol. 2008; 6: 123-137.
8.    Watabe T. Roles of transcriptional network during the formation of lymphatic vessels. J Biochem. 2012; 152: 213–220.
9.    Mendola A., Schlögel M.J., Ghalamkarpour A., et al. Mutations in the VEGFR3 signaling pathway explain 36% of familial lymphedema. Mol Syndromol. 2013; 4: 257–266.
10.    Adams R.H. & Alitalo K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature Mol Cell Biol Rev. 2007; 8: 464-478.
11.    Johnson N.C., Dillard M.E., Baluk P., et al. Lymphatic endothelial cell identity is reversible and its maintenance requires Prox1 activity. Genes Dev. 2008; 22: 3282-3291.
12.    Choi I., Lee S., & Hong Y.-K. The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012; 2: a006445.
13.    Lin F.-J., Chen X., Qin J., et al. Direct transcriptional regulation of neuropilin-2 by COUP-TFII modulates multiple steps in murine lymphatic vessel development. J Clin Invest. 2010; 120: 1694–1707.
14.    Rockson S.G. Update on the biology and treatment of lymphedema. Curr Treat Opt Cardiovasc Med. 2012; 14: 184–192.
15.    Hagura A., Asai J., Maruyama K., et al. The VEGF-C/VEGFR3 signaling pathway contributes to resolving chronic skin inflammation by activating lymphatic vessel function. J Dermatol Sci. 2014; 73: 135–141.
16.    Bouvree K., Brunet I., del Toro R., et al. Semaphorin3A, neuropilin-1, and plexinA1 are required for lymphatic valve formation. Circ Res. 2012; 111: 437-445.
17.    Katsuta H., Fukushima Y., Maruyama K., et al. EphrinB2-EphB4 signals regulate formation and maintenance of funnel-shaped valves in corneal lymphatic capillaries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013; 54: 4102-4108.
18.    Zheng W., Nurmi H., Appak S., et al. Angiopoietin 2 regulates the transformation and integrity of lymphatic endothelial cell