Перейти к содержанию

Premierpharm

Партнёр форума Косметологов

Репутация

101 Excellent

Информация о Premierpharm

  • Звание
    Участник

Информация

  • Пол
    Не определился
  • Город
    Moscow

Посетители профиля

2 148 просмотров профиля
  1. Введение Известно, что инъекционный препарат MesoSculpt C71TM на генном уровне способствует уменьшению массы белой жировой ткани [1]. Это уменьшение достигается за счет нескольких эффектов. Во-первых, препарат ингибирует экспрессию некоторых ключевых факторов адипогенеза (дифференцировки преадипоцитов в адипоциты), тем самым препятствуя росту жировой ткани за счет увеличения количества клеток (гиперплазии). Во-вторых, мезоскальп ингибирует синтез ряда ферментов липогенеза (накопления жиров в существующих адипоцитах), тем самым препятствуя росту жировой ткани за счет увеличения размеров индивидуальных клеток (гипертрофии). Наконец, он способствует активному уменьшению массы жировой ткани, стимулируя синтез ферментов, расщепляющих ранее накопленные липиды (триглицериды жирных кислот в липидных каплях). В данной работе с помощью исследования активности генов, продукты которых непосредственно участвуют в метаболизме липидов или регулируют различные его звенья, мы попытались оценить весомость вклада каждого из ранее описанных механизмов в общий баланс липидов, а также выяснить наиболее вероятные пути утилизации жирных кислот, освобождающихся из липидных капель при индуцированном препаратом гидролизе триглицеридов. Материалы и методы В качестве экспериментальной модели дифференцировки адипоцитов использовали иммортализованную клеточную линию мыши 3T3-L1, способную при соответствующих условиях дифференцироваться в адипоциты. Клетки культивировали в среде Игла модифицированной по Дальбеко, DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Megium, ПанЭко), содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки FBS (HyClone), 2мМ L-глутамина и 10мМ HEPES, pH 7,2-7,4, при температуре 37ºC в увлажненной атмосфере 5% CO2 в пластиковых чашках Петри. Для индукции дифференцировки к клеткам, достигшим 70-80% конфлюентности добавляли изобутилметилксантин (IBMX) и дексаметазон до конечных концентраций 0,5мM и 1мкM, соответственно, на 48 часов. Для оценки влияния MesoSculpt C71TM на дифференцировку преадипоцитов его добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 0,02% на 1,5 часа, после чего клетки отмывали и продолжали выращивать в обычной среде. Смену среды делали каждые 2 дня. Для оценки влияния препарата на зрелые адипоциты его добавляли на 1,5 часа в конце процесса дифференцировки (на 8 сутки). Затем клетки отмывали и культивировали еще 24 часа. Контрольные клетки дифференцировали аналогичным образом, но без добавления MesoSculpt C71TM. По окончании дифференцировки среду удаляли, а к клеткам добавляли реагент, стабилизирующий РНК, RNAprotect Cell Reagent (Qiagen, Германия). После открепления клеток от поверхности чашек Петри под действием реагента образующуюся суспензию переносили в стерильные пластиковые микропробирки и хранили несколько суток в холодильнике до выделения РНК. Выделение и очистку суммарной РНК из клеток осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем набора. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой цепи кДНК с помощью набора обратной транскрипции Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем набора. В качестве матрицы на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл использовали 200 нг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для ПЦР из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР с флуоресцентно мечеными гибридизационными зондами (TaqMan qPCR) проводили с помощью набора qPCRmix-HS (Евроген, Россия) и термоциклера ДТ-322 (ДНК Технология, Россия). В качестве внутреннего стандарта использовали кДНК референсного гена Gapdh. Ее концентрацию измеряли в тех же самых ПЦР смесях, используя меченый другой флуоресцентной меткой гибридизационный зонд: динамику амплификации кДНК для исследуемых генов измеряли по росту флуоресценции в канале Fam, а динамику амплификации для референсного гена – в канале Hex. Полученные данные импортировали в программу Microsoft Exel 2003 и обрабатывали статистически, принимая концентрацию мРНК референсного гена во всех образцах за 1. Для каждого образца проводили минимум три параллельные ПЦР в соседних лунках прибора. Конструирование олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для количественной ПЦР осуществляли с помощью онлайн-сервиса IDT PrimerQuest, а их синтез – в компании Синтол (Россия). Исследование динамики дифференцировки по соотношению размеров клеток и их гранулярности [2] и с помощью липофильного красителя Nile Red осуществляли на проточном цитофлуориметре Beckman-Coulter FC500, используя аргоновый лазер (488 нм). Ультраструктуру залитых в Эпон клеток исследовали на ультратонких срезах, окрашенных уранил-ацетатом и цитратом свинца под электронным микроскопом JEM-1400 (JEOL, Япония). Результаты и их обсуждение На рисунке 1 представлена схема адипогенеза в белой жировой ткани млекопитающих, на которой указаны ключевые регуляторные факторы, исследованные в данной работе. Создать карусель Рис. 1. Факторы регуляции адипогенеза. Зеленым цветом выделены факторы раннего адипогенеза, активируемые адипогенными гормонами и цАМФ. В свою очередь, они индуцируют синтез факторов позднего адипогенеза (выделены синим цветом), контролирующих окончательную дифференцировку и поддержание стабильного фенотипа зрелых адипоцитов. KLF – Krüppel-like factor, CREB – cAMP response element binding protein, C/EBP - CCAAT/enhancer binding protein, GR – glucocorticoid receptor, STAT5A/B – signal transducer and activator of transcription 5A/B, PPARγ – peroxisome proliferator-activated receptor γ, FABP4 – fatty acid binding protein 4, LPIN1 – lipin 1, SREBP-1c - sterol regulatory element binding protein 1c. Красными минусами указаны обнаруженные эффекты мезоскальпа на экспрессию соответствующих генов: один минус – слабое ингибирование (в <2 раза), два минуса – умеренное ингибирование (2-5 раз), три минуса – сильное ингибирование (>5 раз). Побудительным стимулами, запускающими процесс дифференцировки, являются гормональные факторы (глюкокортикоиды, инсулин и гормон роста) и агенты, вызывающие увеличение концентрации цАМФ [3]. Полный цикл адипогенеза занимает 10-12 дней и состоит из двух этапов, каждый из которых контролируется своей особой группой регуляторных факторов. На раннем этапе происходит деление (клональная экспансия) преадипоцитов. Главную роль в этом процессе играют факторы транскрипции C/EBPβ и C/EBPδ. Синтез каждого из них ингибируется мезоскальпом в 1,5-2 раза. По окончании клональной экспансии происходит фосфорилирование молекул C/EBPβ и C/EBPδ, в результате которого они приобретают способность индуцировать синтез факторов позднего адипогенеза. Решающую роль в позднем этапе адипогенеза и поддержании стабильного фенотипа дифференцированных адипоцитов играют мастер-регуляторы адипогенеза, транскрипционные факторы PPARγ и C/EBPα, объединенные в единую регуляторную систему взаимными положительными обратными связями. Наиболее важными «помощниками» мастер-регуляторов являются транскрипционные факторы C/EBPz и SREBP-1c, белок транспорта жирных кислот FABP4 и коактиваторный белок липин 1 (LPIN1, также известный как фосфогидролаза фосфатидных кислот). Мезоскальп оказывает слабо выраженное ингибирующее действие на активность гена PPARγ, умеренно ингибирует экспрессию генов CEBPα, CEBPz и FABP4 и сильно – гена SREBP-1c. Очевидно, MesoSculpt C71TM в значительной степени подавляет адипогенез. Следует подчеркнуть, что транскрипционный фактор SREBP-1c, помимо участия в контроле адипогенеза, играет роль в жизни зрелых адипоцитов как мастер-регулятор экспрессии генов липогенеза. Вполне вероятно, что обнаруженное сильное ингибирование экспрессии гена SREBP-1c мезоскальпом является первичным эффектом этого препарата, а уменьшение экспрессии генов липогенеза, которое будет обсуждаться ниже, вторичными эффектами. Цитофлуориметрическое исследование подтвердило вывод об ингибировании адипогенеза мезоскальпом: добавление препарата одновременно с индукторами дифференцировки почти полностью блокировало образование адипоцитов, а его добавление на поздних этапах дифференцировки значительно (на 35%) уменьшало количество липидов, накопившихся в клетках к концу дифференцировки. Электронно-микроскопическое исследование показало, что при добавлении мезоскальпа на ранних этапах дифференцировки клетки сохраняют морфологические признаки, характерные для преадипоцитов (незначительное содержание липидных капель (ЛК), много митохондрий) даже к концу периода дифференцировки (рис. 2, А и Б). При добавлении препарата на завершающих этапах дифференцировки образуются клетки, более морфологически сходные с нормальными зрелыми адипоцитами, но содержание ЛК в них относительно невелико (рис. 2, В и Г). Создать карусель Рис. 2. Ультраструктура клеток, индуцированных к дифференцировке в разных условиях. А – фрагмент преадипоцита перед добавлением индукторов дифференцировки; немногочисленные липидные капли (ЛК) в цитоплазме (белые пятна). Б – адипоцит после дифференцировки с добавлением мезоскальпа на ранних этапах; немногочисленные ЛК среди множества мелких митохондрий. В – адипоцит после дифференцировки с добавлением мезоскальпа на поздних этапах; содержание ЛК (белые и черные пятна округлой формы) несколько выше, чем в преадипоцитах (А), но существенно ниже, чем в контрольных адипоцитах (Г). Г – адипоцит после дифференцировки в стандартных условиях (без добавления мезоскальпа); многочисленные и более крупные ЛК (белые и черные пятна округлой формы), редкие митохондрии. В зрелых адипоцитах прогрессивное накопление липидов (липогенез) в первую очередь происходит в результате захвата жирных кислот (ЖК) из кровяного русла. Наиболее удобной формой хранения и транспортировки жирных кислот являются триглицериды (ТГ). Однако, сами ТГ не способны проникать через клеточную мембрану, поэтому для переноса внутрь клетки они должны быть гидролизованы специальным ферментом, липопротеинлипазой (lipoprotein lipase, LPL) [4-6]. В просвете капилляров богатые ТГ липопротеины пищевых хиломикронов или образующихся в печени липопротеидов очень низкой плотности (VLDL) расщепляются липопротеинлипазой, а образующиеся при этом свободные ЖК транспортируются внутрь адипоцитов с помощью специального белка, транслоказы ЖК (FAT – Fatty acids translocase, известного также как CD36) (рис. 3). Создать карусель Рис. 3. Гидролиз ТГ на внутренней поверхности капилляров и транспорт ЖК в адипоциты. Молекулы липопротеинлипазы (LPL), синтезируемые в адипоцитах, транспортируются в просвет капилляров и удерживаются на их внутренних стенках с помощью специального гликопротеина. Освобождающиеся при гидролизе ТГ хиломикронов и липидов очень низкой плотности свободные ЖК транспортируются через мембрану адипоцитов белком FAT. В цитоплазме происходит их повторная этерификация и включение образующихся ТГ в липидные капли. Тремя красными минусами показаны обнаруженные сильные (в > 5 раз) ингибирующие эффекты мезоскальпа на экспрессию генов LPL и FAT. Увеличение массы жировой ткани при потреблении богатой жирами пищи в значительной степени определяется именно активностью LPL и FAT. В опытах на трансгенных мышах показано, что усиление экспрессии гена LPL приводит к увеличению массы белой жировой ткани, а ее ослабление – к уменьшению [4]. При инактивации гена FAT наблюдается резкое возрастание концентрации свободных ЖК в плазме крови и ингибирование активности LPL. Ранее мы уже описывали сильный ингибирующий эффект мезоскальпа на экспрессию гена LPL в адипоцитах [1]. В данной работе мы обнаружили, что примерно в такой же степени (в ~5 раз) препарат ингибирует и экспрессию гена FAT. Очевидно, что общим результатом этих двух ингибирующих эффектов должно быть сильно выраженное подавление захвата экзогенных жирных кислот адипоцитами. Одним из побочных эффектов такого подавления может быть резкое усиление захвата глюкозы адипоцитами [7]. Это, в свою очередь, могло бы стимулировать синтез жирных кислот de novo в самих адипоцитах. Поэтому мы исследовали экспрессию генов, кодирующих ключевые ферменты синтеза жирных кислот (рис. 4). Создать карусель Рис. 4. Пути синтеза жирных кислот de novo. Пурпурным шрифтом обозначены ферменты, катализирующие последовательные этапы синтеза: ACL – ATP-citrate lyase, ACC - acetyl-CoA carboxylase, FAS - fatty acid synthase, Elovl - elongation of very long chain fatty acids, SCD - stearoyl-CoA desaturase. Красными минусами указаны обнаруженные эффекты мезоскальпа на экспрессию соответствующих генов: один минус – слабое ингибирование (в <2 раза), два минуса – умеренное ингибирование (2-5 раз), три минуса – сильное ингибирование (>5 раз). Оказалось, что MesoSculptTM C71 сильно (в >5 раз) ингибирует экспрессию генов Elovl3 и Elovl6, умеренно – экспрессию генов ACC и SCD, и не влияет на экспрессию генов FAS и ACL. Следовательно, он в значительной степени подавляет синтез насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот из внутренних источников. Накопление больших количеств триглицеридов в адипоцитах белой жировой ткани сопровождается постепенным слиянием мелких ЛК во все более крупные (рис. 5). Создать карусель Рис. 5. Слияние липидных капель (ЛК) в результате «поглощения» мелких более крупными. FSP27 (CIDEC) – fat specific protein 27 (cell death-inducing DFF45-like effector C). Два красных минуса указывают на обнаруженное умеренное ингибирование экспрессии гена FSP27 (CIDEC) мезоскальпом. Важнейшую роль в этом процессе играют белки семейства CIDE [8]. Считается, что они образуют своеобразные ТГ-проводящие каналы в местах контакта разных ЛК, через которые происходит перенос липидов из одной в другую. При этом направление переноса зависит от соотношения различных белков данного семейства. В белых адипоцитах преобладающим является белок CIDEC, обеспечивающий транспорт липидов из мелких ЛК в более крупные вплоть до образования одной огромной ЛК (в унилокулярных адипоцитах белой жировой ткани диаметр ЛК может достигать 100 мкм и более). Такой вариант (максимальный объем при минимальной поверхности) оптимален для хранения липидов. В бурых адипоцитах преобладает белок CIDEA, обеспечивающий формирование мультилокулярной структуры, оптимальной для активной утилизации липидов. При индукции образования бежевых адипоцитов, например, в результате адаптации к холоду, активируется экспрессия CIDEA и унилокулярная морфология белых адипоцитов сменяется мультилокулярной. Результатом является многократное увеличение площади контакта между липидными каплями и цитоплазмой, что, естественно, способствует более активному липолизу и дальнейшей утилизации освобождающихся жирных кислот. Препарат MesoSculpt C71TM уменьшает уровень экспрессии гена CIDEC примерно в 4 раза, что явно должно препятствовать накоплению липидов в адипоцитах. К тому же, недавно обнаружено, что белок CIDEC ингибирует экспрессию гена ATGL [9] и активность самой липазы ATGL [10]. Следовательно, уменьшение экспрессии гена CIDEC должно приводит к дополнительному усилению липолиза за счет повышения активности ATGL. Липолиз является процессом, противоположным по отношению к липогенезу [11, 12]. При дефиците жирных кислот в активно утилизирующих их органах (миокард, скелетная мускулатура, печень), например, вследствие продолжительного голодания, происходит мобилизация запасенных в адипоцитах жирных кислот. При повышении тонуса симпатической нервной системы происходит стимуляции β-адренорецепторов на поверхности адипоцитов, активация синтеза цАМФ и зависящей от него протеин-киназы А (PKA). Эта протеин-киназа фосфорилирует гормон-чувствительную липазу HSL и белки, ассоциированные с ЛК, перилипины (рис. 6). Создать карусель Рис. 6. Регуляция липолиза в адипоцитах белой жировой ткани. Черными линиями обозначены стимулирующие липолиз влияния, красными – ингибирующие. Справа показаны основные пути утилизации ЖК. AR – адренорецепторы; NPR-A – рецептор натрийуретических пептидов тип А; IR – рецептор инсулина; Gs – G-белок стимулирующего типа; Gi - G-белок ингибирующего типа; AC – аденилат-циклаза; GC – гуанилат-циклаза; PDE – фосфодиэстераза; PKA – протеин-киназа A; PKG – протеин-киназа G; ТГ – триглицериды; ДГ – диглицериды; МГ – моноглицериды; ATGL – ТГ липаза адипоцитов (adipose TG lipase); HSL – гормон-чувствительная липаза (hormone-sensitive lipase); MGL – МГ липаза (monoglyceride lipase); PLIN – перилипин; CGI-58 - comparative gene identification-58; G0S2 – G0/G1 switch 2; GYK – глицерол-киназа; AQP7 – аквапорин 7; PGC1α - peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α; ACSL1 – ацил-КоА-синтетаза 1 (acyl-CoA synthetase-1); UCP1 – разобщающий белок 1 (uncoupling protein 1). Тремя красными минусами показано сильное ингибирование мезоскальпом экспрессии генов G0S2, PLIN1 и PLIN2, двумя – умеренное ингибирование гена PLIN3, красными плюсами – стимулирующие эффекты мезокальпа на экспрессию соответствующих генов: один плюс – слабая стимуляция (в <2 раза), два – умеренная (2-5 раз). Мощными активаторами липолиза являются натрийуретические пептиды. Они действуют через рецептор натрийуретических пептидов А, обладающий гуанилат-циклазной активностью. В результате происходит цГМФ-зависимая активация протеин-киназы G (PKG) и активирующее фосфорилирование липазы HSL и перилипинов. Концентрация натрийуретических пептидов в крови повышается в результате физических нагрузок. Повышение концентрации инсулина, например, после приема пищи, наоборот ингибирует липолиз. Инсулин активирует фосфодиэстеразу 3B, гидролизующую цАМФ, и, тем самым, подавляет PKA-зависимое фосфорилирование. Активность протеин-киназы G подавляется в результате гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой 5, но факторы, активирующие эту фосфодиэстеразу, пока не идентифицированы. Расщепление каждой молекулы триглицеридов происходит на поверхности липидной капли последовательно тремя липазами, ATGL, HSL и MGL. В результате образуется три молекулы ЖК и одна молекула глицерина. Краткосрочная регуляция активности этих липаз осуществляется путем фосфорилирования HSL и перилипинов, в результате которого изменяется сродство ATGL к регуляторным белкам G0S2 и CGI-58, а также доступность поверхности ЛК для липаз и их каталитическая активность. Ключевую роль в этом процессе играет перилипин 1. В отсутствии стимуляции нефософорилированные молекулы перилипина 1 прочно ассоциированны с белком CGI-58, являющимся мощным коактиватором ATGL. Сама ATGL при этом прочно ассоциирована с корепрессорным белком G0S2 и каталитически неактивна. Фосфорилирование перилипина 1 нарушает его ассоциацию с коактиватором CGI-58, в результате чего последний освобождается и, вытесняя корепрессор G0S2, активирует липазу ATGL. При этом происходит и активация всего липолиза в целом, поскольку именно отщепление первой молекулы ЖК от молекулы ТГ является лимитирующей стадией процесса [10]. Длительная адаптация белой жировой ткани к изменившимся условиям внешней или внутренней среды (недостаток пищи, продолжительное охлаждение, избыточные физические нагрузки) достигается путем устойчивых изменений в активности генов. MesoSculpt C71TM умеренно (в ~2 раза) стимулирует экспрессию гена ATGL, несколько слабее (в 1,7 раза) - экспрессию гена HSL, и не влияет на экспрессию гена MGL. Таким образом, наблюдается стимуляция липолиза ТГ. Еще более выраженной эта стимуляция становится, благодаря сильному (>5 раз) ингибированию экспрессии генов перилипина 1 и корепрессорного белка G0S2. В опытах на трансгенных мышах показано, что выключение (knockout) гена PLIN1 приводит к сильно выраженному уменьшению массы белой жировой ткани в результате повышенного базового уровня липолиза [12]. Аналогично, выключение гена G0S2 приводит к выраженной стимуляции [13], а его избыточная экспрессия - подавлению липолиза [14]. Таким образом, умеренная стимуляция мезоскальпом экспрессии генов ATGL и HSL, наряду с подавлением экспрессии генов двух главных ингибиторов ATGL, должна весьма значительно стимулировать липолиз ТГ в адипоцитах белой жировой ткани. Мезокальп также вызывает существенное (в >5 раз) подавление экспрессии гена PLIN2 и умеренное (в ~2 раза) – гена PLIN3. Показано, что в культуре клеток избыточная экспрессия гена PLIN2 приводит к подавлению липолиза ТГ на поверхности ЛК и уменьшает доступность поверхности ЛК для ATGL [15]. Инактивация гена PLIN2 у мышей делает их резистентными к ожирению, вызванному богатой жирами диетой, что коррелирует с увеличением доли бежевых адипоцитов в подкожной жировой ткани [16]. Перилипины 2 и 3 могут взаимно компенсировать недостачу друг друга на поверхности ЛК, а уменьшение их количества способствует доступу ATGL к поверхности ЛК и активации липолиза [17]. Механизмы этих эффектов пока мало изучены, но, какими бы они ни были, ингибирование экспрессии генов PLIN2 и PLIN3 мезоскальпом должно дополнительно стимулировать липолиз ТГ. Перилипин 4 в больших количествах присутствует в белой жировой ткани и в меньших в скелетных мышцах и сердце. В бурой жировой ткани он практически отсутствует [18]. Для перилипина 5 характерна противоположная локализация: его много в клетках с высокой окислительной активностью (бурая жировая ткань, сердце, скелетные мышцы, печень). При липолитической стимуляции адипоцитов агонистом β-адренорецепторов изопротеренолом наблюдается фрагментация ЛК на множество микрокапель, с поверхностью которых ассоциирован перилипин 4 [19]. И хотя функциональное значение этой ассоциации остается загадочным, фрагментация ЛК как таковая очевидно способствует активации липолиза ТГ, увеличивая отношение площади поверхности ЛК, доступной для липаз, к их объему. Мезоскальп заметно (в 4-5 раз) увеличивает уровень экспрессии гена PLIN4, что, вероятно, приводит к стимуляции липолиза. В отличие от перилипина 4 и аналогично перилипину 1 в белой жировой ткани, перилипин 5 в экспрессирующих его клетках препятствует липолизу ТГ в базовом нефосфорилированном состоянии, но этот барьер исчезает при его фосфорилировании протеин-киназой A [20, 21]. В молекуле перилипина 5 обнаружен участок связывания с митохондриями, обеспечивающий прямой физический контакт между этими органеллами и ЛК [22]. Вполне вероятно, что именно эта особенность обуславливает избирательную экспрессию перилипина 5 в бурых адипоцитах и других клетках с высокой оксидативной активностью. Мезоскальп незначительно (в ~ 1,3 раза) повышает уровень экспрессии гена PLIN5. Возможно, это отражает индуцированную препаратом трансдифференцировку части белых адипоцитов в бежевые и объясняет наблюдавшуюся нами с помощью ЭМ тесную ассоциацию ЛК с митохондриями при действии препарата (рис. 7). Создать карусель Рис. 7. Тесная физическая ассоциация ЛК с митохондриями при действии мезоскальпа. А - ЛК окружены множеством митохондрий (M). Различные размеры и окраска ЛК и митохондрий обусловлены их варьирующей ориентацией в трехмерном пространстве клеток по отношению к плоскости среза. Б – ЛК, окруженная митохондриями, при большем увеличении. Одним из главных молекулярных маркеров активного образования новых митохондрий является белок PGC1α [23]. Мы наблюдали умеренную (в ~2 раза) стимуляцию экспрессии гена PGC1α мезоскальпом, что явно свидетельствует об активации биогенеза (образования) митохондрий. Функциональным значением такой активации, по-видимому, является β-окисление ЖК, освобождающихся при индуцированном липолизе ТГ. Такое предположение естественным образом объясняет наблюдающуюся тесную ассоциацию между ЛК и митохондриями в обработанных препаратом адипоцитах. Оно подтверждается также наблюдавшейся нами стимуляцией (в ~2 раза) экспрессии гена ACSL1, которая, как известно, коррелирует с интенсивностью процесса β-окисление ЖК [24]. Таким образом, окисление ЖК в митохондриях является, как минимум, одним из способов утилизации ЖК, освобождающихся из ЛК в результате активации мезоскальпом процессов липолиза. Известно, что в митохондриях большинства клеток, в том числе адипоцитов белой жировой ткани, окисление ЖК сопряжено с синтезом АТФ, в то время как в адипоцитах бурой жировой ткани и подобных им бежевых адипоцитах, окисление ЖК происходит без сопутствующего синтеза АТФ, а освобождающаяся при этом энергия рассеивается в виде тепла [25]. Белок UCP1, ответственный за разобщение процессов окисления и синтеза АТФ, является главным молекулярным маркером бурых и бежевых адипоцитов. Мы обнаружили, что ген UCP1 очень слабо экспрессируется в контрольных адипоцитах, а при добавлении мезоскальпа уровень его экспрессии возрастает в 1,3-1,8 раз, то есть в меньшей по сравнению с генами PGC1α и ACSL1 степени. Логично предположить, что наблюдаемая активация β-окисления ЖК происходит как за счет увеличения количества митохондрий в самих белых адипоцитах, так, отчасти, и за счет трансдифференцировки какой-то части белых адипоцитов в бежевые. Наиболее эффективно, с точки зрения «сжигания» избыточных жиров, окисление ЖК в бежевых адипоцитах, поскольку при этом высвобождаемая энергия не запасается в виде молекул АТФ (которые, в принципе, могут быть использованы и для синтеза новых молекул ТГ), а бесследно рассеивается в форме тепла. Тем не менее, и обычная утилизация ЖК в собственных митохондриях белых адипоцитов может быть вполне эффективным способом уменьшения массы белой жировой ткани [26]. Наконец, нельзя не упомянуть еще о двух возможных способах утилизации освобождающихся при липолизе молекул ЖК. Первый связан с повторной этерификацией ЖК и возвращением образующихся при этом ТГ в ЛК. На первый взгляд, результат такого процесса все возвращает в исходное состояние, поэтому в англоязычной литературе он обозначается как «бесполезный» (futile) цикл. В действительности реэтерификация ЖК требует затрат довольно значительных количеств АТФ и в этом смысле вовсе не является бесполезной. Лимитирующим фактором в «бесполезном» цикле является активность фермента глицерол-киназы (GYK). Оказалось, что мезоскальп не изменяет экспрессии гена GYK, поэтому данный вариант утилизации ЖК, скорее всего, не играет существенной роли в механизмах его липолитического действия. Еще один возможный вариант утилизации ЖК – их освобождение из адипоцитов в кровоток и доставка в другие органы. Оба процесса в значительной степени зависят от экспрессии гена AQP7, кодирующего мембранный белок водно-глицеринового канала. При низкой экспрессии этого гена образующиеся при липолизе молекулы глицерина в основном остаются внутри адипоцита, что приводит к активации утилизации ЖК и глицерина по пути «бесполезного» цикла [27]. Мы не наблюдали сколько-нибудь существенных изменений в уровне экспрессии гена AQP7 под действием мезоскальпа. Следовательно, эффективность утилизации ЖК за счет реэтерификации и экспорта остается на базовом уровне. Это, в свою очередь, означает, что основным способом утилизации ЖК при действии мезоскальпа является их β-окисление в митохондриях белых и бежевых адипоцитов. Создать карусель Добавьте описание Общее обсуждение Результаты описанного исследования подтверждают позиционирование иньекционного препарата MesoSculpt C71 как средства, уменьшающего массу подкожных жировых отложений. При этом механизмы действия препарата множественные. Одним из наиболее выраженных является ингибирование захвата ЖК из пищевых источников за счет подаления активности генов липопротеин-липазы (LPL) и транслоказы ЖК (FAT). Этот механизм, очевидно, наиболее важен при богатой жирами диете. В случае избыточного потребления углеводов на первый план выходит ингибирование активности генов, кодирующих ферменты синтеза ЖК de novo. В обоих случаях увеличению жировой массы препятствует также ингибирование процессов адипогенеза. Наиболее выраженным эффектом, ответственным за уменьшение массы ранее накопленных жиров, является стимуляция процессов липолиза ТГ в адипоцитах белой жировой ткани и последующего β-окисления освобождающихся ЖК в митохондриях, тесно ассоциированных с ЛК. Стимуляция липолиза и последующей утилизации ЖК, в свою очередь, также достигаются за счет множественных эффектов. Во-первых, это – стимуляция собственно расщепления ТГ в результате увеличения экспрессии генов липазы ТГ (ATGL) и гормон-чувствительной липазы ДГ (HSL), а также их «помощника» перилипина 4. Во-вторых, наблюдается ингибирование генов, кодирующих белки, препятствующие липолизу (G0S2 и перилипины 1-3). Наконец, мы обнаружили активизацию β-окисления освобождающихся в результате липолиза ЖК в митохондриях. При этом наблюдается увеличение числа митохондрий в самих адипоцитах белой жировой ткани и, в какой-то степени, трансдифференцировка белых адипоцитов в бежевые, способные наиболее эффективно «сжигать» ЖК без сопутствующего образования АТФ. Судя по соотношению активностей генов, кодирующих маркеры биогенеза митохондрий (PGC1α), β-окисления ЖК в митохондриях (ACSL1) и образования бежевых адипоцитов (UCP1, PLIN5), β-окисление ЖК в собственных митохондриях белых адипоцитов является преобладающим путем их утилизации, а их «сжигание» в бежевых адипоцитах - вспомогательным. Следует оговориться, однако, что в наших экспериментах воздействие препарата на клетки было однократным и непродолжительным. Вполне вероятно, что при более длительном или повторном действии препарата MesoSculpt C71TM вклад альтернативного пути утилизации ЖК, связанного с образованием бежевых адипоцитов, будет более весомым. По своей природе, процесс трансдифференцировки белых адипоцитов в бежевые является эпигенетическим репрограммированием. Это означает, что возникшие бежевые адипоциты останутся таковыми и после окончания действия препарата. При его повторном действии количество бежевых адипоцитов будет увеличиваться, а следовательно будет увеличиваться и их удельный вес в общем балансе утилизации ЖК. Литература Ашапкин В.В., Кутуева Л.И. и Ванюшин Б.Ф. Молекулярно-генетические механизмы действия препарата MesoSculpt C71TM на адипоциты белой жировой ткани. Иньекционные методы в косметологии. 2015, №1, 68-75. 2. Lee Y.-H., Chen S.-Y., Wiesner R.J., & Huang Y.-F. Simple flow cytometric method used to assess lipid accumulation in fat cells. J Lipid Res. 2004; 45: 1162-1167. 3. Siersbaek R., Nielsen R., & Mandrup S. Transcriptional networks and chromatin remodeling controlling adipogenesis. Trends Endocrinol Metab. 2012; 23: 56-64. 4. Voshol P.J., Rensen P.C.N., van Dijk K.W., Romijn J.A., & Havekes L.M. Effect of plasma triglyceride metabolism on lipid storage in adipose tissue: Studies using genetically engineered mouse models. Biochim Biophys Acta. 2009; 1791: 479–485. 5. Bartelt A., Weigelt C., Cherradi M.L., Niemeier A., Tödter K., et al. Effects of adipocyte lipoprotein lipase on de novo lipogenesis and white adipose tissue browning. Biochim Biophys Acta. 2013; 1831: 934–942. 6. Young S.G. & Zechner R. Biochemistry and pathophysiology of intravascular and intracellular lipolysis. Genes Develop. 2013; 27: 459–484. 7. Putri M., Syamsunarnoa M.R.A.A. , Isoa T., Yamaguchi A., Hanaoka H., et al. CD36 is indispensable for thermogenesis under conditions of fasting and cold stress. Biochem Biophys Res Commun. 2015; 457: 520–525. 8. Barneda D., Frontini A., Cinti S., & Christian M. Dynamic changes in lipid droplet-associated proteins in the «browning» of white adipose tissues. Biochim Biophys Acta. 2013; 1831: 924–933. 9. Singh M., Kaur R., Lee M.-J., Pickering R.T., Sharma V.M., et al. Fat-specific protein 27 inhibits lipolysis by facilitating the inhibitory effect of transcription factor Egr1 on transcription of adipose triglyceride lipase. J Biol Chem. 2014; 289: 14481-14487. 10. Grahn T.H.M., Kaur R., Yin J., Schweiger M., Sharma V.M., et al. Fat-specific protein 27 (FSP27) interacts with adipose triglyceride lipase (ATGL) to regulate lipolysis and insulin sensitivity in human adipocytes. J Biol Chem. 2014; 289: 12029-12039. 11. Arner P. & Langin D. Lipolysis in lipid turnover, cancer cachexia, and obesity-induced insulin resistance. Trends Endocrinol Metab. 2014; 25: 255-262. 12. Nielsen T.S., Jessen N., Jørgensen J.O.L., Møller N., & Lund S. Dissecting adipose tissue lipolysis: Molecular regulation and implications for metabolic disease. J Mol Endocrinol. 2014; 52: R199–R222. 13. Zhang X., Xie X., Heckmann B.L., Saarinen A., Czyzyk T.A., & Liu Jun. Targeted disruption of G0/G1 switch gene 2 enhances adipose lipolysis, alters hepatic energy balance, and alleviates high-fat diet–induced liver steatosis. Diabetes. 2014; 63: 934-946. 14. Heckmann B.L., Zhang X., Xie X., Saarinen A., Lu X., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). J Biol Chem. 2014; 289: 1905-1916. 15. Listenberger L.L., Ostermeyer-Fay A.G., Goldberg E.B., Brown W.J., & Brown D.A. Adipocyte differentiation-related protein reduces the lipid droplet association of adipose triglyceride lipase and slows triacylglycerol turnover. J Lipid Res. 2007; 48: 2751–2761. 16. McManaman J.L., Bales E.S., Orlicky D.J., Jackman M., MacLean P.S., et al. Perilipin-2-null mice are protected against diet-induced obesity, adipose inflammation, and fatty liver disease. J Lipid Res. 2013; 54: 1346-1359. 17. Bell M., Wang H., Chen H., McLenithan J.C., Gong D.-W., et al. Consequences of lipid droplet coat protein downregulation in liver cells: Abnormal lipid droplet metabolism and induction of insulin resistance. Diabetes. 2008; 57: 2037-2045. 18. Bickel P.E., Tanseyc J.T., & Welte M.A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochim Biophys Acta. 2009; 1791: 419–440. 19. Brasaemle D.L., Dolios G., Shapiro L., & Wang R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 2004; 279: 46835-46842. 20. Wang H., Bell M., Sreenevasan U., Hu H., Liu J., et al. Unique regulation of adipose triglyceride lipase (ATGL) by perilipin 5, a lipid droplet-associated protein. J Biol Chem. 2011; 286: 15707-15715. 21. Pollak N.M., Jaeger D., Kolleritsch S., Zimmermann R., Zechner R., et al. The interplay of protein kinase A and perilipin 5 regulates cardiac lipolysis. J Biol Chem. 2015; 290: 1295-1306. 22. Wang H., Sreenevasan U., Hu H., Saladino A., Polster B.M., et al. Perilipin 5, a lipid droplet-associated protein, provides physical and metabolic linkage to mitochondria. J Lipid Res. 2011; 52: 2159-2168. 23. Liang H. & Ward W.F. PGC-1α: a key regulator of energy metabolism. Adv Physiol Educ. 2006; 30: 145–151. 24. Ellis J.M., Li L.O., Wu P.-C., Koves T.R., Ilkayeva O., et al. Adipose acyl-CoA synthetase-1 directs fatty acids toward β-oxidation and is required for cold thermogenesis. Cell Metabol. 2010; 12: 53–64. 25. Kajimura S. & Saito M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annu Rev Physiol. 2014; 76: 225–249. 26. Flachs P., Rossmeis M., Kuda O., & Kopecky J. Stimulation of mitochondrial oxidative capacity in white fat independent of UCP1: A key to lean phenotype. Biochim Biophys Acta. 2013; 1831: 986–1003. 27. Hibuse T., Maeda N., Funahashi T., Yamamoto K., Nagasawa A., et al. Aquaporin 7 deficiency is associated with development of obesity through activation of adipose glycerol kinase. Proc Nat Acad Sci USA. 2005; 102: 10993-10998.
  2. ОТКРЫТА регистрация на вебинар компании Premierpharm http://project868549.tilda.ws/ СПИКЕР: Кожина Кристина Витальевна к.м.н., врач косметолог, врач дерматовенеролог, сертифицированный тренер Premierpharm. Стаж работы в эстетической медицине более 15 лет. Вебинар посвящен вопросам омоложения периорбитальной области и гармонизации носа. Авторские методики. ОТКРЫТА регистрация на вебинар компании Premierpharm http://project868549.tilda.ws/
  3. Компания #Premierpharm всегда поддерживает самые значимые научные и образовательные мероприятия. В этот раз наша Компания стала Генеральным Спонсором Международного Балтийского конгресса по пластической хирургии и косметологии, Председателем которого является Наталья Евгеньевна Мантурова - доктор медицинских наук, главный внештатный пластический хирург Министерства здравоохранения РФ. Для профессионального сообщества Балтийский конгресс – важное мероприятие. В конгрессе примут участие более 300 врачей со всей России, 47 ведущих спикеров! 21 и 22 сентября пройдут курсы по косметологии и пластической хирургии, где ведущими специалистами будут обсуждаться актуальные вопросы эстетической медицины. Научная программа включает в себя различные секции, во время которых будут вестись онлайн трансляции из клиник. Спикеры Компании Premierpharm представят новые доклады и мастер-классы по актуальным вопросам эстетической и терапевтической косметологии, тематика докладов подобрана с учетом самых распространенных проблем в работе врачей. Ждём Вас на Балтийском Конгрессе! https://kimbs.ru/
  4. Индивидуальный подход к выбору препарата и сочетанию методик с целью коррекции эстетических проблем Вебинар от компании ПремьерФарм "Индивидуальный подход к выбору препарата и сочетанию методик с целью коррекции эстетических проблем и возрастных изменений кожи. Алгоритмы выбора и эффективного сочетания инъекционных методик" Спикер вебинара - Кожина Кристина Витальевна (к.м.н., врач косметолог, врач дерматовенеролог, сертифицированный спикер компании Премьер Фарм) Сайт ПремьерФарм: https://www.premier-pharm.ru/
  5. 7 сентября в г. Порту завершился 5-ый кадавер-курс с Premierpharm, организованный компаниями «ESTET» и «Школа Профессора Юцковской». Выражаем благодарность руководителю курса профессору Я.А.Юцковской и всем преподавателям курса Г.М.Хрусталевой, Е.В.Байбариной, Г.А.Наумчик за насыщенную образовательную программу, за помощь в отработке практических навыков на диссекционном материале, за профессиональное общение и теплую атмосферу на обучении. Инъекционная #косметология по степени инвазивности и оказываемым эффектам сегодня всерьез соперничает с малой хирургией. Врачу косметологу для успешной практической работы необходимы не только владение нужной методикой, знание всех показаний и противопоказаний для использования тех или иных препаратов, но и отличное знание физиологии и анатомии. Углубленные кадавер-курсы с Premierpharm позволят Вам стать виртуозами в своей профессии, проводить инъекции с учетом глубоких анатомических знаний и навыков, избегая неприятных последствий и осложнений. Приглашаем Вас принять участие в следующих образовательных мероприятиях компании Premierpharm. Все подробности узнавайте у своего менеджера,следите за новостями на нашем сайте и в инстаграм.
  6. Кожина Кристина Витальевна к.м.н., врач косметолог, врач дерматовенеролог, сертифицированный спикер компании ПремьерФарм рассказывает об инъекционном препарате, основу которого составляет не привычная нам гиалуроновая кислота, а запатентованный полипептид Wharton Jelly Peptide P199. Это синтетический аналог естественного пептида человеческого эмбриона, который обеспечивает высокую активность деления стволовых клеток.
  7. Мезоксантин Meso-Xanthin F199 - обзор инъекционного препарата эпигенетической направленности Кожина Кристина Витальевна к.м.н., врач косметолог, врач дерматовенеролог, сертифицированный спикер компании ПремьерФарм рассказывает об инъекционном препарате нового поколения эпигенетической направленности для интенсивной профилактики проявлений фото- и хроностарения кожи под названием Мезоксантин Meso-Xanthin F199 и его применении в косметологии. Высокоактивный препарат, главной особенностью которого является воздействие на генную структуру клеток и возможность выборочно усиливать активность необходимых генов.
  8. В.В. Ашапкин, к.б.н., с.н.с., НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Л.И. Кутуева, м.н.с., НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Б.Ф. Ванюшин, д.б.н., профессор, член-корр. РАН, заведующий отделом, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Стимуляция дренажной активности лимфатической системы Введение Помимо общих изменений кожи, обусловленных хронологическим и внешним старением, существует проблема, свойственная индивидам обоих полов и самого разного возраста – темные круги и мешки под глазами. К сожалению, ухудшение эластических свойств кожи и аномалии отложения липидов с возрастом усугубляют и эту проблему. Вполне очевидно, с другой стороны, что она ухудшается не только с возрастом, но и при состояниях общей усталости, например при недостатке сна. Очевидно, темные круги и мешки под глазами являются не только возрастной, но и, в значительной степени, физиологической проблемой. Замечено, что эта проблема более характерна для определенных этнических групп, а также часто наблюдается у разных членов одной и той же семьи. Это наводит на мысль, что существуют генетически обусловленные особенности, влияющие на степень ее выраженности у конкретных индивидов. Гистологические исследования показывают, что непосредственные причины темных кругов и мешков под глазами весьма разнообразны. Среди наиболее типичных – отложения меланина, гиперпигментация после атопического или аллергического дерматита, поверхностное расположение сосудов, сниженный тонус кожи, вирусные и паразитарные инфекции, заболевания щитовидной железы [1, 2]. Частой причиной отеков является недостаточная дренажная активность лимфатической системы. Накопление жидкости в межуточном (интерстициальном) пространстве периферических тканей является результатом ультрафильтрации плазмы крови с содержащимися в ней молекулами через эндотелиальный слой артериальной и венозной капиллярной сети [3]. Движущей силой этого процесса является баланс гидростатического и осмотического давлений между внутренним пространством микрососудов кровеносной системы и межуточным пространством окружающей ткани. Обратный захват межуточной жидкости (МЖ) и ее возвращение в кровеносную систему осуществляет главным образом лимфатическая система. Вместе с плазмой в межуточное пространство выходят также белки и малые молекулы. Специальный матрикс из гликопротеинов и гликозаминогликанов (гликокаликс) на внутренней поверхности эндотелиальных клеток (ЭК) и между ними играет роль своеобразного сита с вариабельным размером пор, регулируя скорость фильтрации и состав МЖ. После захвата капиллярами лимфатической системы МЖ становится лимфой. Состав лимфы в значительной степени зависит от периферической ткани, в которой она формируется. В нее попадают продукты процессинга компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), роста и ремоделирования ткани, катаболизма клеток, обломки гибнущих клеток, тканеспецифические белки и другие молекулы. Лимфатическая система состоит из первичных (капилляров) и вторичных (собирающих) лимфатических сосудов (ЛС), лимфатических узлов (ЛУ) и ассоциированных с ними лимфоидных органов [4]. В отличие от кровеносной системы, она является незамкнутой и обеспечивает поглощение МЖ, иммунных клеток и макромолекул капиллярами и их однонаправленный транспорт через собирающие ЛС к ЛУ, а от них – в кровеносное русло (рис.1). В каждый ЛУ впадает несколько афферентных сосудов, а выходит один более крупный, эфферентный. В конце концов, лимфа попадает в грудной лимфатический проток и правый лимфатический ствол, а из них, через специальные лимфовенозные клапаны рядом с местом впадения внутренней и внешней яремных вен, в подключичную вену. Лимфовенозные клапаны предотвращают проникновение крови из вен в ЛС. Главными функциями лимфатической системы являются регуляция жидкостного гомеостаза тканей и движение клеток иммунной системы. В тонком кишечнике лимфатические капилляры выполняют особую функцию – поглощение и транспорт хиломикронов, выделяемых клетками кишечного эпителия. Основные успехи в исследовании лимфатической системы связаны с идентификацией специфических для лимфатических эндотелиальных клеток (ЛЭК) молекулярных маркеров. Наиболее важные из них: рецептор васкулярных эндотелиальных факторов роста VEGFR3 (vascular endothelial growth factor receptor 3), фактор транскрипции PROX1 (prospero homeobox 1), мембранный гликопротеин PDPN (podoplanin) и лимфатический эндотелиальный рецептор гиалуроновой кислоты (ГК) LYVE1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1). Рис. 1. Организация лимфатической системы. А – однонаправленное движение лимфы от лимфатических капилляров (1) через собирающие сосуды (2) и лимфоузлы (3) в грудной лимфатический проток и правый лимфатический ствол (4), впадающие в подключичную вену. Б – лимфатические капилляры поглощают межуточную жидкость (МЖ), макромолекулы и иммунные клетки, выходящие из кровеносных капилляров, через «откидные клапаны» в промежутках между прерывистыми межклеточными контактами. В – в собирающих лимфатических сосудах (ЛС) эндотелиальные клетки соединены непрерывными контактами, содержат двустворчатые клапаны и имеют оболочку из гладкомышечных клеток (ГМК). Г – в лимфатический узел входит несколько афферентных ЛС, а выходит один эфферентный ЛС (направление движения лимфы указано стрелками). Д – лимфа достигает венозной системы через специальные лимфовенозные клапаны (стрелки), расположенные рядом с местами впадения внешней и внутренней яремных вен (ЯВ) в подключичную вену (ПКВ). Лимфатические капилляры образуются монослоем ЭК, имеющих форму дубового листа и лежащих на неплотной базальной мембране (БМ), и не содержат поддерживающего слоя гладкомышечных клеток (ГМК) (рис.2). Контакты между соседними ЛЭК в капиллярах имеют прерывистый («пуговичный») характер [5]. При повышении давления МЖ происходит натяжение якорных филаментов, соединяющих зоны межклеточных контактов с волокнами ВКМ. В результате перекрывающиеся участки соседних ЛЭК между контактами оттягиваются друг от друга и обеспечивают более активный вход МЖ и иммунных клеток в лимфатическое русло. Таким образом, проницаемость капилляров автоматически регулируется в соответствии с потребностью в их дренажной активности. Рис. 2. Особенности структурной организации различных ЛС. Лимфатические капилляры не содержат сплошной оболочки из БМ и ГМК и состоят из монослоя ЛЭК, имеющих форму дубового листа и соединенных прерывистыми межклеточными контактами, промежутки между которыми играют роль «откидных» клапанов для входа жидкости, макромолекул и иммунных клеток из межуточного пространства. Зоны межклеточных контактов соединяются с волокнами внеклеточного матрикса специальными якорными филаментами. Собирающие ЛС имеют оболочку из БМ и ГМК, состоят из ЛЭК удлиненной формы, соединенных сплошными межклеточными контактами, и содержат люминальные двустворчатые клапаны, обеспечивающие однонаправленный ток лимфы. Участок сосуда между соседними клапанами называется лимфангионом (lymphangion). Лимфатические капилляры сливаются в более крупные собирающие сосуды. Последние образуются монослоем ЭК, лежащим на сплошной БМ и поддерживающей оболочке из мышечных клеток, фибробластов и соединительной ткани. В собирающих ЛС ЭК имеют вытянутую форму, а контакты между ними непрерывные (zipper-like junctions), что предотвращает вытекание лимфы. Мышечные клетки, сочетающие свойства гладкой и скелетной мускулатуры, обеспечивают тонус и периодические сокращения ЛС, стимулирующие центростремительное движение лимфы. В просвете собирающих ЛС присутствуют двустворчатые клапаны, которые открываются синхронно с их сокращениями. Клапаны состоят из соединительной ткани, покрытой специализированными ЛЭК. Скорость течения лимфы может заметно изменяться при патологических состояниях, способствующих усиленному лимфангиогенезу, движению клеток, увеличению объема и тока лимфы, увеличению продукции медиаторов воспаления, влияющих на сократимость лимфатических сосудов. Исследования врожденных нарушений жидкостного гомеостаза и других функций лимфатической системы показали, что в их основе чаще всего лежат дефекты генов, кодирующих функционально важные белки ЛЭК [6-9]. Очевидно, функциональная активность лимфатической системы и зависящие от нее состояния тканей определяются экспрессией этих генов. Поэтому мы исследовали эффекты препарата MesoEye™ C71 на уровни экспрессии генов, кодирующих функционально важные белки эндотелиальных клеток. Материалы и методы В качестве объекта исследования использовали культивируемые эндотелиальные клетки HMVEC-D (human dermal microvascular endothelial cells), полученные из микрососудов кожи человека и представляющие собой смесь эндотелиальных клеток кровеносных и лимфатических сосудов (компания Lonza, CC-2543). После размораживания клетки культивировали на среде EGM-2 MV BulletKit (Lonza CC-3202) при температуре 37оC в увлажненной атмосфере 5% CO2 в пластиковых чашках Петри в течение 2 пассажей. Для оценки влияния MesoEye™ C71 на клетки его добавляли к среде (10 мкл на 1 мл среды) перед началом третьего пассажа и выращивали клетки до формирования монослоя. Контрольные клетки выращивали аналогично, но без добавления препарата. По окончании третьего пассажа среду удаляли, а к клеткам добавляли реагент, стабилизирующий РНК, RNAprotect Cell Reagent (Qiagen, Германия). После открепления клеток от поверхности чашек Петри под действием реагента образующуюся суспензию переносили в стерильные пластиковые микропробирки и хранили несколько суток в холодильнике до выделения РНК. Выделение и очистку суммарной РНК из клеток осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) по прописи, рекомендованной фирмой-производителем набора. Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой цепи кДНК с помощью набора обратной транскрипции Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США) по рекомендованной производителем прописи. В качестве матрицы на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл использовали 200 нг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для ПЦР из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР с флуоресцентно мечеными гибридизационными зондами (TaqMan qPCR) проводили с помощью набора qPCRmix-HS (Евроген, Россия) и термоциклера ДТ-322 (ДНК Технология, Россия). В качестве внутреннего стандарта использовали референсный ген GAPDH. Концентрацию его транскриптов измеряли в тех же самых ПЦР смесях, используя гибридизационный зонд меченый другой флуоресцентной меткой: динамику амплификации кДНК для исследуемых генов измеряли по росту флуоресценции в канале Fam, а динамику амплификации кДНК для референсного гена – в канале Hex. Уровень экспрессии каждого гена измеряли в трех параллельных экспериментах на независимо полученных образцах клеток (биологические параллели). Для каждого образца проводили минимум три параллельные ПЦР в соседних лунках прибора (технические параллели). Полученные данные импортировали в программу Microsoft Exel 2003 и обрабатывали статистически, принимая концентрацию мРНК референсного гена во всех образцах за 1. Конструирование олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для количественной ПЦР осуществляли с помощью онлайн-сервиса IDT PrimerQuest https://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index , а их синтез – в компании Синтол (Россия). Результаты и их обсуждение Развитие и базовая функциональная активность лимфатической системы На первом этапе мы исследовали эффекты MesoEye C71™ на экспрессию генов, детерминирующих развитие и фенотипические свойства ЛЭК. Главными функциями лимфатической системы являются участие в иммунных ответах и обратный захват жидкости, белков и клеток из тканей для их возвращения в кровеносное русло. В ходе эмбрионального развития лимфатическая система образуется из ЭК кардинальной вены. Этот процесс запускается гетеродимером факторов транскрипции NR2F2 и PROX1. Одним из главных молекулярных маркеров ЛЭК у взрослых млекопитающих является VEGFR3 (также известный как FLT4) – рецепторная тирозин-киназа, активируемая васкулярными эндотелиальными факторами роста VEGFC и VEGFD [10]. Во время раннего эмбриогенеза ген VEGFR3 экспрессируется в кровеносных сосудах, а в позднем эмбриогенезе и постнатально – только в лимфатических (рис. 3). Как показано на рисунке 3, добавление MesoEye™ C71 многократно (в 6,5 раз) увеличивает экспрессию гена VEGFR3. В ходе эмбрионального развития ЛС начинают формироваться после начала кровообращения, у человека на 6-7 неделе, у мыши на 9-10 день (E9,5-10). В субпопуляции ЭК общей кардинальной вены индуцируется экспрессия гомеобокс-содержащего фактора транскрипции PROX1. Это и служит первичным сигналом детерминации развития этих клеток по лимфатическому пути. Рис. 3. Этапы развития лимфатической системы и контролирующие их гены (в скобках – дни эмбрионального развития у мыши). КВ – кардинальная вена; пЛЭК – первичные ЛЭК; пПЛС – периферический продольный лимфатический сосуд; пГП – первичный грудной проток. Красными плюсами показаны гены, экспрессия которых стимулируется MesoEye C71: + – в 1,5-2 раза, ++ – в 2-5 раз, +++ – в >5 раз. У мыши к E10,5 первичные ЛЭК покидают вены и мигрируют в виде слабо скрепленных групп, которые впоследствии сливаются в первичные лимфатические структуры (лимфатические мешки). Яремные лимфатические мешки состоят из двух сосудов – первичного грудного протока и периферического продольного лимфатического сосуда. Клетки, соединяющие первичный грудной проток и кардинальную вену, сливаются в лимфовенозные клапаны, предотвращающие попадание крови в лимфатическую систему. Большая часть периферической лимфатической сосудистой сети развивается центробежно из лимфатических мешков путем лимфангиогенеза, то есть образования новых сосудов путем ветвления уже существующих. Однако некоторые ЛЭК вначале существуют как обособленные группы клеток, отделенные от участвующих в лимфангиогенезе. Сливаясь, они образуют новые сосуды, которые затем соединяются с основной лимфатической сетью (механизм лимфоваскулогенеза). Рецептор ГК LYVE1 участвует в процессах адгезии и межклеточного взаимодействия, и узнает не только ГК, но и другие компоненты ВКМ, такие как остеопонтин, коллагены и металлопротеиназы. При добавлении MesoEye C71™ уровень экспрессии гена LYVE1 повышается в 2 раза. Еще одним специфическим маркером ЛЭК является трансмембранный гликопротеин муцинового типа подопланин (PDPN). Нуль-мутации по гену PDPN приводят к лимфатическим отекам, расширению ЛС и общему ухудшению дренажной функции лимфатической системы. Уровень экспрессии гена PDPN при добавлении MesoEye C71™ увеличивается в 5,7 раз. Фактор транскрипции PROX1 считается мастер-регулятором лимфатического фенотипа [11, 12]. Нуль-мутации по гену PROX1 у мыши приводят к тому, что ЭК отпочковываются от кардинальной вены, но не пролиферируют и не дифференцируются в ЛЭК. Суперэкспрессия PROX1 в ЭК кровеносных сосудов, напротив, индуцирует экспрессию специфических для ЛЭК маркеров. Для поддержания идентичности ЛЭК необходима постоянная экспрессия PROX1, в противном случае происходит их обратное превращение в венозные ЭК. Возможно, такая пластичность необходима для гибкой адаптации сосудистой системы к изменяющимся условиям. Добавление MesoEye C71™ умеренно (в 2,7 раза) стимулирует экспрессию PROX1. Природа сигналов, индуцирующих начало экспрессии PROX1 в части ЭК кардинальной вены, не до конца выяснена. Для специализации ЛЭК необходима экспрессия фактора транскрипции SOX18 до начала экспрессии PROX1. Он узнает участок промотора гена PROX1 и непосредственно стимулирует его активность. Для индукции экспрессии PROX1 необходим также фактор транскрипции NR2F2. Важным механизмом его действия является индукция корецептора VEGFC, NRP2 [13]. Мутации по гену NRP2 приводят к гипоплазии лимфатических капилляров, но не влияют на развитие кровеносных сосудов. Отпочкование ЛЭК от лимфатических мешков абсолютно зависимо от сосудистого фактора роста VEGFC: у VEGFC-дефицитных мышей ЛС не образуются вовсе. Добавление MesoEye C71™ приводит к умеренному повышению уровней экспрессии генов NR2F2 (в 3 раза) и NRP2 (в 3,3 раза), но практически не влияет на активность генов SOX18 и VEGFC. Мутация по гену белка CCBE1 (collagen and calcium binding EGF domains 1) является причиной синдрома Хеннеками – одной из форм первичной лимфедемы. Ген CCBE1 экспрессируется в области развивающихся ЛС и в развивающемся сердце эмбрионов. У мышей, дефектных по CCBE1, нарушено отпочкование первичных ЛЭК от кардинальной вены, и первичные лимфатические мешки не образуются. CCBE1 связывается с определенными белками ВКМ и повышает активность сигнального пути VEGFR3, стимулируя расщепление VEGFC до полностью зрелой активной формы металлопротеазой ADAMTS3 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 3). Дефектные по ADAMTS3 мышиные эмбрионы не имеют периферической лимфатической сосудистой сети, и погибают после E15 вследствие глобального отека тканей. Добавление MesoEye™ C71 приводит к небольшой (в 1,8 раза) стимуляции экспрессии CCBE1, но не влияет на экспрессию ADAMTS3. После образования первичного лимфатического сплетения происходит созревание лимфатической сети, включающее формирование иерархического древа из лимфатических капилляров, преколлекторов и собирающих сосудов. В собирающих ЛС происходит образование клапанов, рекрутирование ГМК и формирование БМ. Между E17,5 и P28 в лимфатических капиллярах происходит переход от сплошных межклеточных контактов к прерывистым. Существенную роль в этом переходе играет сигнальный путь ангиопоэтина 2 (ANGPT2). Добавление MesoEye C71™ умеренно (в 2 раза) стимулирует экспрессию гена ANGPT2. В созревании собирающих ЛС участвует несколько сигнальных путей. Первый из них, FOXC2/CNB1/NFATC1, необходим не только для созревания собирающих ЛС и образования клапанов, но и для поддержания их целостности в постнатальный период. FOXC2 действует кооперативно с CNB1/NFATC1. Другие молекулы, участвующие в этом процессе, это – белки щелевых контактов коннексины CX26, CX37, и CX43, RELN (reelin), EMILIN1 (elastin microfibril interfacer 1), SEMA3A, NRP1, EFNB2/EPHB4 (ephrin-B2/EPH receptor B4), GDF2 (growth differentiation factor 2), ALK1 (activin A receptor type 1), TGFBR2 (transforming growth factor β receptor 2), и GATA2 (GATA binding protein 2). Добавление MesoEye C71™ умеренно стимулирует экспрессию генов FOXC2 (в 2,7 раза), SEMA3A (в 3 раза) и EFNB2 (в 2,2 раза), слабо стимулирует экспрессию генов NFATC1 (в 1,8 раза), RELN (в 1,5 раза) и EPHB4 (в 1,5 раза) и не влияет на активность остальных генов. Независимо от конкретной причины, при недостаточно активном оттоке лимфы (лимфостазе) происходит накопление жидкости в межуточном пространстве и опухание соответствующих участков тела [14]. Когда лимфостаз носит хронический характер, наблюдается разная степень кожного и подкожного фиброза и, часто, значительные отложения подкожного жира. В сумме эти паталогические явления обозначаются как лимфедема. Она может возникать также в результате нарушений пролиферации лимфатических микрососудов. Последнее может приводить к различным метаболическим нарушениям, а также местным и системным нарушениям активности иммунной системы. Течение жидкости по ЛС обеспечивается несколькими силами. В случае сосудов в скелетных мышцах - компрессией со стороны окружающих мышц: благодаря наличию клапанов, она обеспечивает проталкивание лимфы в центральном направлении. В других тканях, таких как внутренние органы или кожные покровы, главной движущей силой являются сокращения ГМК самих ЛС. Они усиливаются по частоте и амплитуде при повышенном давлении в сосудах под действием симпатической нервной системы, гормонов и простаноидов. Нарушения достаточного движения лимфы приводят к лимфедеме. Отек развивается, когда продукция МЖ превышает ее отток. При определенных условиях продукция МЖ может увеличиться в 10-20 раз, что превышает возможности лимфотока и вызывает выраженный отек. Мутации гена VEGFR3 у человека являются одной из наиболее частых причин наследственных лимфатических отеков (лимфедем) [9]. Главный лиганд VEGFR3 в лимфатических сосудах, VEGFC, стимулирует пролиферацию и выживание ЛЭК в условиях клеточной культуры. В модели контактной хронической гиперчувствительности у мышей аденовирусная экспрессия VEGFC уменьшала признаки хронического воспаления (увеличенные лимфатические сосуды, отек, инфильтрация макрофагов), а экспрессия антител к VEGFR3 – наоборот, усугубляла их [15]. Очевидно, VEGFR3-зависимая активность VEGFC приводит к разрешению воспаления, усиливая дренажную активность ЛС. Как уже отмечалось выше, добавление MesoEye C71™ сильно (в 6,5 раз) стимулирует уровень экспрессии гена VEGFR3 и не влияет на экспрессию гена VEGFC. В целом это свидетельствует об усилении дренажной активности ЛС под действием препарата. Клапаны и проницаемость лимфатических сосудов К врожденным лимфатическим отекам, фиброзу конечностей и повышенной чувствительности к инфекциям приводят и дефекты образования двустворчатых клапанов в собирающих ЛС [16]. Лимфатические клапаны образуются из специализированных ЛЭК, экспрессирующих гены факторов транскрипции PROX1, FOXC2 и GATA2. FOXC2 отвечает за позиционирование и спецификацию клапанов: его утрата приводит к отсутствию клапанов и аномальному току лимфы. Мутации FOXC2 у человека приводят к лимфедеме и дистихиазу (двойному ряду ресниц). Как уже отмечалось, при действии MesoEye™ C71 экспрессия генов PROX1 и FOXC2 увеличивается примерно в 2,7 раза. На активность гена GATA2 препарат не влияет. После спецификации клетки лимфатических клапанов отделяются от стенки сосуда, вытягиваются и мигрируют в просвет сосуда, формируя сердцевидные пластинки, препятствующие обратному току лимфы (рис. 4). Рис. 4. Морфогенез двустворчатых клапанов в собирающих лимфатических сосудах. Группы ЛЭК, экспрессирующих на высоком уровне факторы транскрипции PROX1, FOXC2 и GATA2, обособляются в участках бифуркаций и возмущенного лимфотока (белые пунктирные стрелки). Участок будущего клапана устанавливается индукцией экспрессии белка щелевых контактов (gap junctions) коннексина 37 (CX37), активацией сигнального пути CNB1/NFATC1, переориентацией ЛЭК и накоплением ламинина α5 (LAMA5) во ВКМ. Створки клапана образуют кольцевую структуру в результате взаимодействия интегрина α9 (ITGA9) с фибронектином (FN1) и активации сигнального пути SEMA3A/NRP1/PLXNA1. Затем происходит инвагинация, образование сквозного протока и элонгация створок клапана: образуется зрелый клапан, состоящий из двух двуслойных створок. Каждая из створок содержит плотную сердцевину ВКМ (FN1; показана темно-оранжевым цветом). Лимфоток становится однонаправленным (сплошные белые стрелки). Взаимодействие ЛЭК клапанов, через экспрессируемый в них лиганд SEMA3A, с ГМК, экспрессирующими рецептор NRP1, приводит к их взаимному отталкиванию, тем самым поддерживая область клапана в свободном от ГМК состоянии. Постоянная активность сигнальных путей CNB1/NFATC1 и EFNB2 важна для поддержания стабильного фенотипа ЛЭК створок клапана. Эти ЛЭК имеет особый молекулярный профиль (показан в прямоугольнике). Красными плюсами показаны гены, экспрессия которых стимулируется MesoEye C71: + – в 1,5-2 раза, ++ – в 2-5 раз. Для вытягивания ЛЭК будущего клапана необходимо взаимодействие мембранного рецептора интегрина α9 (ITGΑ9) с его лигандом во ВКМ, фибронектином (FN1). Существенную роль в образовании лимфатических клапанов играет ген SEMA3A, кодирующий секретируемый белок семейства семафоринов. Экспрессия генов ITGA9 и SEMA3A под действием MesoEye C71™ увеличивается в 1,5 и 3 раза, соответственно, а экспрессия гена FN1 не изменяется. Важную роль в образование клапанов в собирающих ЛС играет трансмембранный лиганд EFNB2. Связываясь с рецепторной тирозин-киназой EPHB4, он запускает сигнальный каскад, приводящий к взаимному отталкиванию EFNB2-экспрессирующих и EPHB4-экспрессирующих клеток. Через особый C-концевой PDZ-связывающий мотив EFNB2 также генерирует «обратный» сигнал, необходимый для ветвления (ангиогенеза) ЛС. В собирающих ЛС ген EFNB2 сильно экспрессируется в клетках двустворчатых клапанов. У мутантных мышей, не имеющих PDZ-связывающего мотива EFNB2, клапаны в ЛС отсутствуют. Индуцибельная делеция гена EFNB2 в зрелых ЛС приводит к уменьшению числа клапанов и их деформации. Очевидно, обратный сигналинг EFNB2 необходим как для образования клапанов, так и для их стабильного поддержания в уже сформировавшихся ЛС. Во внутреннем пространстве лимфатических капилляров клапаны отсутствуют. Интересным исключением являются лимфатические капилляры роговицы, в которых обнаружены микроклапаны [17]. В этих капиллярах ЛЭК клапанов активно экспрессируют ген EPHB4, а окружающие ЛЭК - ген EFNB2. Нарушение активности сигнального пути EFNB2– EPHB4 препятствует образованию и поддержанию клапанов. При добавлении MesoEye™ C71 уровни экспрессии генов EFNB2 и EPHB4 увеличиваются в 2,2 и 1,5 раза, соответственно. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что формирование клапанов в ЛС и их дальнейшее поддержание в присутствии MesoEye C71™ более эффективны. Это, несомненно, должно улучшать дренажную функцию ЛС. Проницаемость эндотелия ЛС в значительной степени определяется экспрессией ангиопоэтина 2 (ANGPT2). При дефиците ANGPT2 в лимфатических капиллярах нарушается преобразование межклеточных контактов из сплошных в прерывистые [18]. Тем самым затрудняется захват жидкости и других компонентов лимфы из межуточного пространства. В собирающих ЛС при этом нарушается структура адгезионных контактов и формирование клапанов. Это приводит к «подтеканию» собирающих ЛС и нарушению нормального тока лимфы. В целом недостаточно активная экспрессия ANGPT2 сильно нарушает основную дренажную функцию лимфатической системы. Экспрессия гена ANGPT2 под действием MesoEye C71™ увеличивается в 2 раза. Важную роль в регуляции проницаемости лимфатического эндотелия играют также молекулы десмоплакина, цитоплазматического якорного белка, связывающего средние филаменты с клеточной мембраной. При добавлении MesoEye C71™ уровень экспрессии гена десмоплакина (DSP) возрастает на порядок (в ~10 раз). Это свидетельствует о стабилизации эндотелия ЛС и уменьшении проницаемость их стенок. В то же время, это не должно ухудшать дренажную функцию лимфатических капилляров, поскольку захват жидкости и других компонентов лимфы из межуточного пространства происходит через межклеточные участки, свободные от адгезионных и плотных контактов. В сумме перечисленные эффекты MesoEye C71™ должны кардинально улучшать целостность ЛС и усиливать их дренажную активность. Заключение MesoEye C71™ стимулирует функциональную активность лимфатической системы в целом и дренажную функцию ЛС в частности, благодаря усилению экспрессии генов VEGFR3 (рецептора васкулярного эндотелиального фактора роста C), NRP2 (его корецептора), PROX1 (мастер-регулятора фенотипа лимфатических эндотелиальных клеток), NR2F2 (важного фактора венозного и лимфатического ангиогенеза), LYVE1 (специфического для ЛЭК рецептора ГК) и PDPN (специфического для ЛЭК трансмембранного гликопротеина). Улучшению дренажной функции ЛС способствует активация под действием препарата экспрессии генов, ответственных за формирование и поддержание двустворчатых клапанов в ЛС (PROX1, FOXC2, ITGA9, EFNB2 и EPHB4), а также стимуляция экспрессии генов десмоплакина (DSP) и ангиопоэтина 2 (ANGPT2), стабилизирующих стенки ЛС. Список литературы 1. Freitag F.M. & Cestari T.F. What causes dark circles under the eyes? J Cosmet Dermatol. 2007; 6: 211–215. 2. Sobel R.K., Carter K.D., & Allen R.C. Periorbital edema: a puzzle no more? Curr Opin Ophthalmol. 2012; 23: 405–414. 3. Hansen K.C., Alessandro A.D., Clement C.C., & Santambrogio L. Lymph formation, composition and circulation: a proteomics perspective. Internat Immunol. 2015; 27: 219–227. 4. Aspelund A., Robciuc M.R., Karaman S., Makinen T., & Alitalo K. Lymphatic system in cardiovascular medicine. Circ Res. 2016; 118: 515-530. 5. Baluk P., Fuxe J., Hashizume H., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 2007; 204: 2349-2362. 6. Ferrell R.E., Kimak M.A., Lawrence E.C., & Finegold D.N. Candidate gene analysis in primary lymphedema. Lymphatic Res Biol. 2008; 6: 69-76. 7. Ji R.-C. Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation. Lymphatic Res Biol. 2008; 6: 123-137. 8. Watabe T. Roles of transcriptional network during the formation of lymphatic vessels. J Biochem. 2012; 152: 213–220. 9. Mendola A., Schlögel M.J., Ghalamkarpour A., et al. Mutations in the VEGFR3 signaling pathway explain 36% of familial lymphedema. Mol Syndromol. 2013; 4: 257–266. 10. Adams R.H. & Alitalo K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature Mol Cell Biol Rev. 2007; 8: 464-478. 11. Johnson N.C., Dillard M.E., Baluk P., et al. Lymphatic endothelial cell identity is reversible and its maintenance requires Prox1 activity. Genes Dev. 2008; 22: 3282-3291. 12. Choi I., Lee S., & Hong Y.-K. The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012; 2: a006445. 13. Lin F.-J., Chen X., Qin J., et al. Direct transcriptional regulation of neuropilin-2 by COUP-TFII modulates multiple steps in murine lymphatic vessel development. J Clin Invest. 2010; 120: 1694–1707. 14. Rockson S.G. Update on the biology and treatment of lymphedema. Curr Treat Opt Cardiovasc Med. 2012; 14: 184–192. 15. Hagura A., Asai J., Maruyama K., et al. The VEGF-C/VEGFR3 signaling pathway contributes to resolving chronic skin inflammation by activating lymphatic vessel function. J Dermatol Sci. 2014; 73: 135–141. 16. Bouvree K., Brunet I., del Toro R., et al. Semaphorin3A, neuropilin-1, and plexinA1 are required for lymphatic valve formation. Circ Res. 2012; 111: 437-445. 17. Katsuta H., Fukushima Y., Maruyama K., et al. EphrinB2-EphB4 signals regulate formation and maintenance of funnel-shaped valves in corneal lymphatic capillaries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013; 54: 4102-4108. 18. Zheng W., Nurmi H., Appak S., et al. Angiopoietin 2 regulates the transformation and integrity of lymphatic endothelial cell
  9. Начало учебного года не только у школьников и студентов! Профессия врача подразумевает под собой постоянное самообразование и развитие. Premierpharm в Португалии Первый день обучения на кадавер-курсе! Первая лекция еще не закончилась, а рабочие тетради уже исписаны. Лекция Яны Александровны Юцковской как всегда невероятно насыщенна информацией, практическими рекомендациями и бесценным опытом работы с пациентами. Продолжаем обучение для дальнейшей эффективной работы!
  10. Врачам-косметологам представится возможность отрабатывать необходимые манипуляции на трупном материале в группах по 4 человека. Под руководством руководителей курса изучаются мельчайшие детали анатомического строения областей лица и шеи, разнообразные техники инъ- екций и возможные осложнения после проведения манипуляций, самостоятельно отрабатывают- ся мануальные навыки. Насыщенная научно-практическая программа чередуется с развлекательно-экскурсионной программой, обязательным завершением программы Cadaver Course является вручение Сертификатов, подтверждающих успешное прохождение курса. Университет Порту (Universidade do Porto) является не только самым большим университетом Португалии, но и самым престижным, занимая лидирующее место в системе высшего образование Португалиии опережая по многим показателям своих ближайших конкурентов: университет Лиссабона и университет Коимбры. Лаборатория Института биомедицинских наук ICBAS специализируется на практических курсах по анатомии и хирургической технике на трупах. Каждая из имеющихся рабочих станций имеет встроенную камеру для записи упражнений или проекции работы. Подробнее тут: https://www.premier-pharm.ru/premierpharm-cadaver
  11. Патогенетически обоснованная коррекция фотостарения и дисхромий инъекционным препаратом Meso-Xanthin F199™ Григорьева Анна Александровна – врач-косметолог, сертифицированный тренер компании Premierpharm, Москва Берзегова Лариса Вадимовна – к.м.н., врач-косметолог, ведущий спикер компании Premierpharm, сертифицированный тренер компании Premierpharm, Москва Кожина Кристина Витальевна– к.м.н., врач-косметолог, сертифицированный тренер компании Premierpharm, Москва Родина Юлия Алексеевна - к.м.н., врач-косметолог, сертифицированный тренер компании Premierpharm, Москва Лоран Мария Сергеевна - врач-косметолог, сертифицированный тренер компании Premierpharm, Москва Морозов Сергей Георгиевич – д.м.н., член-корреспондент РАН, ВРИО Директора по науке ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАН, Москва Выделяют два основных независимых друг от друга механизма старения кожи: фотостарение, вызванное воздействием ультрафиолета (УФ) и хронологическое (возрастное) старение. Фотостарение зависит не от возраста пациента, а от суммарной дозы облучения и степени естественной защиты. Под воздействием ультрафиолетовых лучей происходят значительные изменения во всех слоях кожи. В эпидермисе – гиперкератоз, изменение цветности, обезвоженность. Со временем снижается тургор кожи, появляется дряблость, постепенно формируются глубокие морщины, эластоз и актиническая пурпура. Таким образом, ксероз, гиперпигментация и морщины являются клиническими проявлениями фотостарения. В основе этих изменений лежит увеличение синтеза активных форм кислорода (АФК). сопровождается АФК повышают уровень пептида-активатора 1, стимулирующего активность матричных металлопротеиназ, что приводит к разрушению коллагена. В то же время АФК снижают содержание фактора роста TGF-β2, отвечающего за синтез нового коллагена. Одним из защитных механизмов кожи против воздействий УФ является активная продукция меланина и перенос его из меланоцитов в кератиноциты с помощью меланосом. Меланин препятствует проникновению УФ в глубокие слои кожи и блокирует выброс АФК. Поддержание постоянной пигментации кожи - сложный многоэтапный процесс: миграции меланобластов в ткань в течение эмбриогенеза, их жизнеспособности и дифференцировки в меланоциты, плотности меланоцитов в коже, экспрессии и функций энзиматических и структурных компонентов меланосом, синтеза различных типов меланин (эу- и феомеланина), созревания и транспортировки меланосом в дендритные отростки меланоцитов и переноса их в кератиноциты, и, наконец, от распространения меланина в супрабазальных слоях кожи. Нарушение регуляции любого из этапов синтеза меланина может привести к потере пигментации, формированию участка кожи измененного цвета, появлению пигментных пятен и опухолей. Основным фактором, влияющим на меланогенез является УФ, который активирует УФ-чувствительные белки, стимулирующие избыточный синтез меланина. Но, независимо от эндогенной или экзогенной природы сигнала, активируется рецептор-1 к меланокортину – главный пусковой механизм меланогенеза. После его активации увеличивается экспрессия основного регулятора меланогенеза – мастера транскрипционной регуляции пигментации – MITF. Его контролирует фактор Sox10. MITF запускает экспрессию тирозина – фермента, контролирующего синтез меланина. Также MITF запускает экспрессию gp100 – фактора, регулирующего созревание меланосом и синтез эумеланина – пигмента черного цвета Возможности косметической коррекции и профилактики дисхромий кожи в настоящий момент очень разнообразны. Для подавления гиперпигментации и аномального меланогенеза необходимо применение препаратов, способных оказать воздействие на разных этапах и уровнях регуляции синтеза меланина, механизм действия, эффективность и безопасность которых подтверждена не только клиническими, но и лабораторными научными исследованиями. Таким препаратом является Meso-Xanthin F199™, который активно применяется для эффективного решения различных эстетических проблем кожи, профилактики фотостарения и коррекции дисхромией. Ключевой компонент препарата – каротиноид Фукоксантин F-199 (Fucoxanthin F-199) - обладает мощным эффектом воздействия на репарацию ДНК стволовых и специализированных клеток, поврежденных в условиях оксидантного стресса, при фотоповреждении и в процессе хроностарения. Известно, что фукоксантин оказывает защитное воздействие при различной патологии. В частности, установлено, что после УФ-воздействия на мышей, фукоксантин ингибирует тирозинкиназу и снижает экспрессию мРНК MCR1 и тирозиназа-зависимого рецептора 1. Кроме того, в состав инъекционного препарата Meso-Xanthin F199™ входят антиоксиданты, снижающие уровень АФК в коже; тиоредоксин, восстанавливающий оксилительно-восстановительный баланс в меланосомах и переключающий синтез с эумеланина на феомеланин; витамин А, ингибирующий УФ-индуцированный меланогенез; а также другие факторы, способствующие восстановлению и поддержанию гомеостаза кожи. Для изучения in vitro эффективности и механизмов действия комбинированных препаратов в настоящее время используют первичные культуры меланоцитов и кератиноцитов и тканевые эквиваленты Меланодерм. Такой подход, позволяет оценить биоэффективность и безопасность различных препаратов, провести анализ их молекулярных мишеней и прогнозировать вероятные последствия воздействия. Для оценки эффективности препарата Meso-Xanthin F199™, в Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАН (г.Москва) и Российской медицинской Академии последипломного образования Минздрава РФ (г.Москва) были проведены эксперименты с добавлением этого инъекционного препарата к органотипической культуре Меланодерм и культуре из меланоцитов кожи человека. Выбранные объекты позволили объективно оценить степень воздействия Meso-Xanthin F199™ на различные этапы меланогенеза. Органотипическая культура была представлена тканевыми эквивалентами. Образцы для тестирования получали следующим образом: в планшет для культивирования помещалась специальная вставка для культивирования с пористой мембраной. На мембрану в дальнейшем послойно наносили разные типы клеток в необходимом соотношении. В соответствии с протоколом, образцы инкубировали до образования межклеточных связей и формирования базальной мембраны. Результаты эксперимента на образцах Меланодерм (при добавлении Meso-Xanthin F199™ и без него) можно оценить даже визуально благодаря накоплению пигмента и потемнению образцов. На Рисунке 3 видно, как в процессе культивирования потемнели контрольные образцы (без Meso-Xanthin F199™) по сравнению с экспериментальными (с Meso-Xanthin F199™). В результате спектрофотометрического анализа высушенных образцов было установлено, что к 7 суткам концентрация меланина в контрольных образцах превышала концентрацию меланина в экспериментальных (Рисунок 4). Возникает вопрос, почему вообще происходило потемнение? В соответствии с протоколом исследования, использовалась готовая среда, стимулирующая меланогенез. В таких условиях невозможно его полное подавление, однако препарат Meso-Xanthin F199™ способствовал равномерному распределению пигмента в тканевом эквиваленте, в отличие от контрольного образца, где пигмент распределен не равномерно. Данные общего гистологического анализа тканевых эквивалентов Меланодерм показали, что в процессе культивирования в контрольной группе происходит увеличение толщины клеточного слоя меланоцитов (стрелки) (Рисунок 5). В экспериментальной группе толщина слоя меланоцитов к 7 суткам культивирования увеличивалась незначительно (стрелки) (Рисунок 5). Это свидетельствует о том, что препарат Meso-Xanthin F199™ не подавляет пролиферацию меланоцитов. Для дальнейшей оценки влияния Meso-Xanthin F199™ на экспрессию ключевых факторов меланогенеза: gp100, MITF, Sox10, MCR1 и TYR был проведен иммуноцитохимический анализ срезов тканевых эквивалентов Меланодерм. В результате анализа было установлено, что в контрольной группе экспрессию MITF (мастер транскрипционной регуляции пигментации – основной регулятор меланогенеза) наблюдали уже в 1 сутки культивирования, а к 7 суткам ее выявляли во всем тканевом эквиваленте, тогда как в опытной (в присутствии Meso-Xanthin F199™), экспрессия данного транскрипционного фактора выявлялась только на третьи и незначительно увеличивалась к 7 суткам (Рисунок 6). Процесс меланогенеза происходит в меланосомах – внутриклеточных везикулярных органеллах, с помощью которых осуществляется дальнейший трансфер пигмента в кератиноциты. За полное созревание меланосом и синтез эумеланина ответственен белок gp100. В результате иммуноцитохимического анализа было установлено, что уровень экспрессии gp100, отвечающего за созревание меланосом, снижен в опытной группе (в присутствии Meso-Xanthin F199™) по сравнению с контрольной на 1, 3 и 7 сутки культивирования. Транскрипционный фактор Sox10 относится к ключевым «игрокам» клеточного метаболизма и регулирует множество внутриклеточных процессов, в том числе экспрессию фактора MITF, морфогенез и клеточную дифференцировку, подавляет апоптоз. Изменение экспрессии Sox10 может нарушить нормальное функционирование клетки и привести к развитию тяжелых патологических состояний. В результате анализа было установлено, что Meso-Xanthin F199™ не оказывает влияния на экспрессию Sox10. После проведенного иммуноцитохимического анализа было установлено, что Meso-Xanthin F199™ первостепенно влияет на экспрессию фактора созревания меланосом gp100 и, в меньшей степени, воздействует на экспрессию мастера транскрипции регуляции пигментации MITF и не влияет на транскрипционный фактор Sox10. В ходе работы было установлено, что в экспериментальных образцах экспрессия гена рецептора 1 к меланокортину (MCR1) была достоверно ниже, чем в контрольной группе на 7 сутки культивирования. Экспрессия гена тирозиназы (TYR) практически полностью была подавлена в эксперименте на 7 сутки культивирования в сравнении с контрольными образцами (Рисунок 9). Такое максимальное воздействие инъекционного препарата к последнему дню культивирования in vitro может свидетельствовать о накопительном эффекте. Полученные данные свидетельствуют об избирательности воздействия Meso-Xanthin F199™ – он подавляет созревание меланосом и интенсивный синтез меланина, однако не блокирует основные пути меланогенеза, следовательно, не вызывает тяжелые патофизиологические осложнения. Для подтверждения отсутствия токсичности и биобезопасности воздействия препарат Meso-Xanthin F199™ непосредственно на меланоциты, препарат добавляли в ростовую среду (в соотношении объемов: 1:10, 1:100, 1:1000), далее проводили исследование на жизнеспособность и пролиферативную активность меланоцитов. Клетки сохраняли свою жизнеспособность, морфологию, способность мигрировать и пролиферировать (Рисунок 10). Анализ поведения клеток выявил увеличение индекса пролиферации в экспериментальной группе, к которой был добавлен инъекционный препарат Meso-Xanthin F199™ в максимальной концентрации (Рисунок 11). В итоге: в ходе исследования было установлено, что Meso-Xanthin F199™ стимулирует пролиферацию меланоцитов в культуре и не способствует увеличению числа дифференцированных меланоцитов в тканевых эквивалентах. Meso-Xanthin F199™ in vitro проявил себя как препарат с высокой биологической активностью: снижает гиперчувствительность к сигналу, активирующему меланогенез; подавляет избыточный меланогенез через супрессию тирозиназы; регулирует экспрессию мастера транскрипционной регуляции меланогенеза MITF; препятствует созреванию меланосом и синтезу эумеланина через фактор gp100 (Рисунок 12). Результаты, полученные в ходе исследования, свидетельствуют об избирательности воздействия Мeso-Хanthin F199ТМ –подавляет созревание меланосом и интенсивный синтез меланина, однако не блокирует основные пути меланогенеза, следовательно, не вызывает тяжелые патофизиологические осложнения. Таким образом, препарат Meso-Xanthin F199ТМ является высокоэффективным и безопасным средством для профилактики фотостарнения и коррекции дисхромий. ППОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ ПРЕПАРАТА MESO-XANTHIN F199™ В КОСМЕТОЛОГИИ: Профилактика и терапия «увядания» кожи. 2. Терапия дисхромий и меланогенетических пятен. 3. Коррекция возрастных изменений (морщины, потеря тонуса и эластичности, гравитационный птоз I-II степени) 4. Профилактика и терапия синдрома обезвоженной кожи. 5. Подготовка кожи к пластическим операциям. 6. Реабилитация кожи в послеоперационном периоде. 7. Восстановление кожи после срединных и глубоких пилингов, лазерных шлифовок и других инвазивных процедур. В ДЕРМАТОЛОГИИ: Синдром постакне. 2. Синдром фенотипически жирной кожи. 3. Синдром кожи курильщика. 4. Акне 1-2 стадии (вне обострения). 5. Розацеа. 6. Розацеаподобный демодекоз. 7. Фотодерматозы, сопровождающиеся образованием меланогенетических пятен. 8. Себорейный дерматит. 9. Ксероз кожи. ХОД ПРОЦЕДУРЫ Провести «демакияж». Перед введением Meso–Xanthin F199TM трижды обработать кожу 0,05% раствором хлоргексидина. Возможно местное применение крема с анестетиком. Рекомендуемая игла: 32G (0,23х4мм). Препарат не предназначен для объемного депонирования в коже. Процедура проводится по линиям Лангера от центра к периферии (Рис. 13). Объем одного шприца 1,5 мл рассчитан на обработку 3-х зон: лица, шеи, декольте. Техника введения: • Множественные внутридермальные микроинъекции (техника «микробугорков»): o в кожу лица игла вводится под углом 45° к поверхности кожи, на глубину 4 мм, с интервалом между вколами от 0,8 до 1 см. (Рис. 14, 15). o в кожу шеи игла вводится под углом 30° к поверхности кожи на глубину 1-2 мм (Рис. 16, 17). Направление среза иглы не принципиально. • В периорбитальной зоне возможно использование техники «микропапул» (Рис. 18): o для повышения контроля над однократной дозой введения препарата срез иглы должен быть направлен вверх. o диаметр папулы не должен превышать 1 мм. o несоблюдение рекомендации может привести к выраженному отеку этой зоны лица. После процедуры рекомендуется нанести восстанавливающую маску Meso-Wharton P199™ Post-Treatment Mask с охлаждающим эффектом (Рис. 19). РРЕКОМЕНДОВАННЫЕ КУРСЫ ПРОЦЕДУР  Базовый курс: 6 процедур с интервалами 7-14 дней;  Поддерживающий курс:1 процедура Meso–Xanthin F199TМ 1 раз в 8 недель  Повторный базовый курс: через 12 месяцев. РЕЗЮМЕ Применение Meso-Xanthin F199™ позволяет проводить эффективную коррекцию признаков фотостарения кожи, обеспечивает выравнивание цветности кожи, нормализацию себопродукции, интенсификацию восстановительных процессов в коже и реабилитацию кожи, в том числе и у пациентов с хроническими дерматозами, а также является высокоэффективным и безопасным средством против гиперпигментации. Рисунок 1. Влияние УФ на меланогенез (John A. D’Orazio, Stuart Jarrett, Amanda Marsch, James Lagrew and Laura Cleary / "Recent Advances in the Biology, Therapy and Management of Melanoma" (2013)). Рисунок 2. Эксперименты на «3D» моделях тканевых эквивалентах Меланодерм и сфероидах из меланоцитов, проведенные в Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАН (г.Москва) и Российской медицинской Академии последипломного образования Минздрава РФ. Рисунок 3. Накопление пигмента в тканевых эквивалентах Меланодерм (фотографии высушенных образцов перед спектрофотометрией). Рисунок 4. Спектрофотометрический анализ результатов эксперимента, проведенного на образцах Меланодерм, культивируемых вместе с инъекционным препаратом Meso-Xanthin F199 и без него (*р<0,05 в сравнении с контрольной группой) Рисунок 5. Рис.3. Гистологический анализ тканевых эквивалентов Меланодерм контрольной (А) и экспериментальной (Б) групп на 1, 3 и 7 сутки культивирования (световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозин). Стрелками отмечены меланоциты. Рисунок 6. Иммуноцитохимический анализ экспрессии MITF контрольной и экспериментальной групп на срезах тканевых эквивалентов на 1, 3, 7 сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий - ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный - MITF. Рисунок 7. Иммуноцитохимический анализ экспрессии gp100 контрольной и экспериментальной групп на срезах тканевых эквивалентов на 1, 3, 7 сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий - ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный - gp100. Рисунок 8. Иммуноцитохимический анализ экспрессии Sox10 контрольной и экспериментальной групп на срезах тканевых эквивалентов на 1, 3, 7 сутки культивирования (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Синий - ядра клеток, окрашенные Hoechst 33258; красный - Sox10. Рисунок 9. ПЦР-анализ тканевых эквивалентов Меланодерм. Метод ПЦР в реальном времени, RQ – относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену TBP. *р<0,05 в сравнении с другими разведениями на соответствующем пассаже. Рисунок 10. Динамика пролиферации в 2D культуре. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия. Рисунок 11. Гистограмма значений индекса пролиферации культуры меланоцитов на 3 и 4 пассаже в трех экспериментальных (разведение препарата Meso-Xanthin F199™ 1:10, 1:50 и 1:100) и контрольной группах. *р<0,05 в сравнении с другими разведениями на соответствующем пассаже. Рисунок 12. Воздействие Meso-Xanthin F199™ на различных участников меланогенеза Рисунок 13. Схема введения препарата Meso-Xanthin F199™ Рисунок 14-15. Техника введения Meso-Xanthin F199™ в кожу лица Рисунок 16-17. Техника введения Meso-Xanthin F199™ в кожу шеи Рисунок 18. Техника введения Meso-Xanthin F199™ в кожу периорбитальной зоны Рисунок 19. Восстанавливающая маска Meso-Wharton P199™ Post-Treatment Mask Рисунок 20. Пациентка: 37 лет. Диагноз: дисхромия, синдром фенотипически жирной кожи. А, Б – До процедур. В, Г – После проведения 4 процедур Meso-Xanthin F199™ с интервалом 10 дней. Результат: уменьшение выраженности гиперпигментаций, улучшение цветности кожи, матирование кожи, сужение пор, выравнивание микрорельефа кожи, гидратация кожи.
  12. ВНИМАНИЕ вебинар начинается! ССЫЛКА ДЛЯ БЕСПЛАТНОГО ПРОСМОТРА: https://www.premier-pharm.ru/webinar-premierpharm
  13. ИНТЕНСИВНАЯ РЕПАРАЦИЯ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ «КЛЕТОЧНАЯ» ТЕРАПИЯ КОЖИ Meso-Xanthin F199 ИНЪЕКЦИОННЫЙ ПРЕПАРАТ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ФОТО- И ХРОНОСТАРЕНИЯ, ИНТЕНСИВНОЙ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕПАРАЦИИ КЛЕТОК И РЕГЕНЕРАЦИИ ПОВРЕЖДЕННОЙ И ВОЗРАСТНОЙ КОЖИНа сегодняшний день MesoXanthin F199™это единственный препарат, который на эпигенетическом уровне избирательноактивирует репаративные процессы в клетках, способствует поддержанию стабильности их генетического аппарата и самовосстановлению поврежденных клеток кожи, «защищает» их от воздействия внешних и внутренних агрессивных факторов.
  14. Сочетанное применение MESO-WHARTON P199™ C КОСМЕТИКОЙ НА ОСНОВЕ WHARTTON JELLY PEPTIDE P199™Крем стимулирует процессы репарации кожи, активирует локальные обменные процессы, обладает дренирующим свойством, укрепляет стенки микрокапилляров, регулирует и нормализует процесс меланогенеза, разглаживает морщины.В составе Facial Renewal сream находятся следующие активные компоненты: Sh-oligopeptide-72 / #WhartonJelly Peptide P199™, пептиды зародышей пшеницы, экстракт бамбука, экстракт зеленого горошка. Показаниями к применению являются: морщины, отеки и пастозность в пераорбитальной зоне, «гусиные лапки», темные круги вокруг глаз. Данный крем способствует коррекции инволюционных изменений, обусловленных снижением темпов клеточного обновления кожи и уровня синтетической активности клеток, нарушением физиологической регуляции жизнедеятельности клеток и структуры коллаген-эластинового каркаса дермы, а также замедлением репарации кожи. Крем инициирует и поддерживает процессы клеточного обновления, реструктуризации и репарации кожи.
  15. Premierpharm

    Meso-Xantin F199 и Epi-oral F199 эффективный комплекс "must have"

    17 августа ВЕБИНАР на тему:Meso-Xantin F199 и Epi-oral F199 эффективный комплекс "must have"Регистрация по ссылке https://www.premier-pharm.ru/webinar-premierpharm
×