Цитобиохимическое обоснование ремоделирующего действия Hyalual в коже

Куприянова А.В., врач-дерматолог, косметолог, руководитель учебного центра Hyalual Россия.

Кирова Ю.И., главный научный сотрудник лаборатории биоэнергетики и проблем гипоксии ФГБНУ НИИ Общей патологии и патофизиологии, доктор биол. наук

Лаборатории биоэнергетики и проблем гипоксии ФГБНУ НИИ Общей патологии и патофизиологии, г. Москва.

Исследование эффектов сукцината, реализуемых через специфический рецептор SUCNR1 (GPR91), было начато в 2004 году, когда сукцинатный рецептор был идентифицирован в клетках почек как стимулятор секреции ренина (He W. et al., 2004).

Согласно современным представлениям янтарная кислота (Hyalual) является молекулярным маркером гипоксических/ишемических состояний и продуцируется митохондриями не только в ходе прямого окислительного развития цикла Кребса (при достаточном уровне О2 в клетке), но и в ходе восстановительного обращения цикла Кребса при гипоксии (Ariza A.C. et al., 2012). Срочные антигипоксические SUCNR1-зависимые эффекты янтарной кислоты могут реализовываться локально в участке ишемизированной ткани по типу аутокринного/паракринного сигнала (вазодилятация) (Hamel D. et al., 2014; Toma I. et al., 2008), а также на системном уровне (секреция ренина почками, увеличение артериального давления) (He W. et al., 2004; Toma I., 2008).

Исследования активности SUCNR1 проводились на ткани почек (He W. et al., 2004; Toma I., 2008), сердца (Aguiar C.J. et al., 2010), мозга (Hamel D. et al., 2014; Sapieha P. et al., 2008), сетчатки глаза (Sapieha P., 2012), печени и практически не затронули кожу, в то время как положительные эффекты сукцинатсодержащего препарата(Hyalual), применяемого в дерматологии и косметологии, хорошо известны и заключаются в ускорении заживления ран, омоложении кожи (Borumand M., 2015; Domingoa J.L. et al., 1988; Zarubina I.V. et al., 2012), устранении гиперпигментации (Denton C.R. et al., 1952; Yasuda M. et al., 1995), противовоспалительном и противоаллергическом действии (Boyle J. et al., 1986).

В связи с необходимостью обоснования легитимности практического применения с целью восстановления репаративных свойств кожи сукцинатсодержащего препарата Hyalual на базе лаборатории биоэнергетики и проблем гипоксии ФГБНУ НИИ Общей патологии и патофизиологии, г. Москва, было инициировано исследование.

Цель исследования состояла в выявлении возможных SUCNR1-опосредованных механизмов активности сукцинатсодержащего препарата Hyalual в коже.

 

ЗЗадачи исследования:

(1) Провести выявление SUCNR1 в образцах кожи интактных крыс и перенесших курс внутрикожных инъекций сукцинатсодержащего препарата Hyalual, используя метод Вестерн-блот анализа;

(2) Идентифицировать SUCNR1-положительные клетки кожи, используя метод иммуногистохимии;

(3) Оценить количество и морфологические особенности клеток кожи в контрольной и опытной группах.

ММатериалы и методы:

Использованные препараты (субстанции). Сукцинатсодержащий препарат Hyalual® (препарат для курсовой процедуры редермализации, инъекционная форма; концентрация гиалуроновой кислоты 1,1%, 1,8%, 2,2%; содержание сукцината 1,6%), мексидол (инъекционная форма, 50 мг/мл), физ. раствор (инъекционная форма), 1,6% раствор сукцината натрия, чистая высокомолекулярная гиалуроновая кислота концентрацией 1%, 1.8%, 2%.

Схема эксперимента. Внутрикожное введение препарата Hyalual и препаратов сравнения проводилось трехкратно с двухнедельными перерывами.

ММетоды идентификации и визуализации данных:

Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ). Метод позволяет, сочетая белковый электрофорез и применение антител, проводить высокоспецифичную идентификацию белков в образцах биологических тканей.

Гистологическая обработка кожи- позволяет визуализировать искомые объекты в тканях после обработки антителами и окрашивания.

ИИммуноцитохимия

Иммуноцитохимический метод – метод идентификации в клетке различных белков, основанный на реакции антиген-антитело. Метод был использован для определения содержания белков SUCNR1 в поперечных срезах кожи передней брюшной поверхности.

РРезультаты и обсуждение:

Метод Вестерн-блот анализа позволил выявить SUCNR1 в образцах кожи передней брюшной стенки крыс всех экспериментальных групп: интактной (без воздействий), контрольной (инъекции физ. раствора), опытной (инъекции препарата Hyalual), группы сравнения I (инъекции гиалуроновой кислоты), группы сравнения II (инъекции мексидола), группы сравнения III (инъекции раствора сукцината Na). Трехкратное введение препаратов с двухнедельными интервалами согласно стандартной схеме не влияло на уровень рецептора, который не отличался от базового (в коже интактных крыс) (рис. 1). Факт отсутствия снижения уровня SUCNR1 после применения Hyalual может свидетельствовать о выборе адекватной дозы, при отмене которой риск развития зависимости от препарата и синдрома отмены минимален.

 

Рис. 1. Фотографии и данные количественной оценки иммуноблотов образцов лизатов кожи передней брюшной стенки крыс после трехкратного внутрикожного введения сукцинатсодержащих препаратов (Hyalual, мексидол, сукцинат Na).

Окрашивание срезов кожи гематоксилин-эозином. Для окрашивания были получены поперечные срезы дермы (сосочковый, сетчатый слои) и гиподермы кожи передней брюшной стенки контрольных (инъекции физ. раствора) и опытных (инъекции Hyalual) крыс. В дерме контрольных животных было выявлено высокое содержание фибробластов веретеновидной формы (рис. 2 А,Б), макрофаги и тучные клетки (рис. 2 Б,В). В сравнении с контролем в срезах кожи опытных животных количество фибробластов возросло (рис. 2 Г), а морфология этих клеток изменилась (увеличение размеров и количества отростков), что свидетельствует об их активации. Следует отметить, что стимуляция пролиферации фибробластов сукцинатом в сочетании с гиалуроновой кислотой, отмечается и в других исследованиях (Borumand M., 2015). Также на срезах кожи опытных крыс выявлялись признаки вазодилатации и увеличения плотности сосудистой сети (рис. 2 Д).

Иммуногистохимическое окрашивание срезов кожи контрольных и опытных крыс с применением антител к SUCNR1 показало, что клеточные элементы кожи (кератиноциты, фибробласты, макрофаги, тучные клетки, гладкомышечные клетки, эндотелиоциты) в разной степени экспрессируют рецептор (рис. 3), а наиболее высокие уровни SUCNR1 были выявлены в тучных клетках, нейтрофилах и макрофагах (рис. 3 Д,Е). Интенсивность экспрессии SUCNR1 не менялась после завершения курса введения Hyalual (рис. 4).

Данные морфологического и имуногистохимического исследований свидетельствуют о реализации SUCNR1-зависимых механизмов активности сукцинатсодержащего препарата Hyalual. В связи с тем, что рецептор в больших количествах экспрессируется в макрофагах, тучных клетках, нейтрофилах можно предположить не только прямое влияние Hyalual на фибробласты и кератиноциты кожи (активация, пролиферация, миграция), например через продукцию PGE2 (Konger R.L. et al., 1998; Toma I. et al., 2008), но и опосредованное иммунными клетками, как более чувствительными сенсорами уровня сукцината.

 

Рис. 2. Микрофографии поперечных срезов кожи передней брюшной стенки крыс, инъецированных физиологическим раствором (А, Б, В) и препаратом Hyalual (Г, Д, Е). Окрашивание гематоксилин-эозином. Увеличение 200.

 

Рис. 3. Микрофотографии поперечных срезов кожи передней брюшной стенки крыс, инъецированных физиологическим раствором (контроль). Иммуногистохимическое окрашивание с использованием антител к SUCNR1. Увеличение 200.

 

Рис. 4. Микрофотографии поперечных срезов кожи передней брюшной стенки крыс, инъецированных препаратом Hyalual (опыт). Иммуногистохимическое окрашивание с использованием антител к SUCNR1. Увеличение 200.

Известно, что активация кератиноцитов и переключение с неактивного статуса на миграционный, пролиферативный, провоспалительный происходит под действием провоспалительных цитокинов (Behm B. et al., 2012), секретируемых макрофагами и тучными клетками. NGF, TGF, VEGF, продуцируемые макрофагами, тучными клетками, лимфоцитами (Leon A. et al., 1994; Pincelli C. et al., 1994; Santambrogio L. et al., 1994) играют критическую роль в пролиферации и миграции дермальных фибробластов, ремоделировании тканей и заживлении ран (Palazzo E. et al., 2012). Макрофагальный PDGF является митогеном и хемотаксическим агентом для фибробластов, гладкомышечных клеток и воспалительных клеток (Lynch S.E. et al., 1987). Макрофаги продуцируют растворимые медиаторы, регулирующие миграцию, пролиферацию и синтез коллагена фибробластами (Freundlich B. et al., 1986).

Вывод: таким образом, полученные данные говорят о больших возможностях препарата Hyalual для решения многочисленных задач в репаративной медицине, косметологии и пластической хирургии,трихологии. Наличие рецептора к сукцинату (SUCNR1) на поверхности практически всех дермальных компонентов(фибробластов, тучных клеток, макрофагов, эндотелиоцитов, свидетельствует о вовлеченности сукцинатсодержащего препарата(Hyalual) в функциональную активацию клеток кожи, пролиферацию, миграцию, секрецию ростовых факторов, цитокинов, хемокинов, т.е. причастности Hyalual к механизмам регенерации, обновления и репарации кожи. Полученные данные так же согласуются с недавними исследованиями, начатыми в 2016 г., доказавшими сопряжение метаболизма и сигнальной функции сукцината с иммунной и репаративной функцией резидентных макрофагов в коже. поскольку они пролиферируют, мигрируют в области повышения концентрации сукцината(Hyalual) (Diepen, 2017), где стимулируют пролиферацию фибробластов, ангиогенез, подавление механизмов воспаления.

 

Применение сукцинатсодержащего препарата (Hyalual) может рассматриваться как эффективный подход в коррекции возрастных изменений кожи, связанных с активацией механизмов воспаления, снижением репаративного и пролиферативного потенциала кожи и подлежащих тканей.

 

Литература

Aguiar C.J., Andrade V.L., Gomes E.R., Alves M.N., Ladeira M.S., Pinheiro A.C., Gomes D.A., Almeida A.P., Goes A.M., Resende R.R., Guatimosim S., Leite M.F. Succinate modulates Ca(2+) transient and cardiomyocyte viability through PKA-dependent pathway // Cell Calcium. – 2010. – V. 47, N 1. – P. 37–46.

Ariza A.C., Deen P.M.T., Robben J.H. The succinate receptor as a novel therapeutic target for oxidative and metabolic stress-related conditions // Frontiers in Endocrinology. Molecular and Structural Endocrinology. – 2012. – V. 3. – P. 1-8.

Behm B., Babilas P., Landthaler M., Schreml S. Cytokines, chemokines and growth factors in wound healing. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 26, 812–820 (2012).

Borumand M. Combination treatment with hyaluronic acid, succinate, and collagen: a novel approach to skin rejuvenation. J Clin Exp Dermatol Res 2015, 6:3.

Boyle J., Burton J.L., Faergemann J. Use of topical lithium succinate for seborrhoeic dermatitis British Medical Journal 292, 28 (1986).

Correa P.R., Kruglov E.A., Thompson M., Leite M.F., Dranoff J.A., Nathanson M.H. Succinate is a paracrine signal for liver damage // J Hepatol. – 2007. – V. 47, N 2. – P. 262–269.

Denton CR, Lerner AB, Fitzpatrick TB. Inhibition of Melanin Formation by Chemical Agents. The Journal of Investigative Dermatology 1952; 18: 119–135

Domingoa J.L., Gómeza M., Llobeta J.M., Corbellab J. Citric, malic and succinic acids as possible alternatives to deferoxamine in aluminum toxicity. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology 1988; 26(1-2).

Freundlich B., Bomalaski J.S., Neilson E., Jimenez S.A. Regulation of fibroblast proliferation and collagen synthesis by cytokines. Immunol Today 7(10):303-7 (1986).

Hakak Y., Lehmann-Bruinsma K., Phillips S., Le T., Liaw C., Connolly D.T., Behan D.P. The role of the GPR91 ligand succinate in hematopoiesis // J. Leukoc. Biol. - 2009. – V. 85, N 5. – P. 837–843.

Hakak Y., Lehmann-Bruinsma K., Phillips S., Le T., Liaw C., Connolly D.T., Behan D.P. The role of the GPR91 ligand succinate in hematopoiesis // J. Leukoc. Biol. - 2009. – V. 85, N 5. – P. 837–843.

Hamel D., Sanchez M., Duhamel F., Roy O., Honore J.-C., Noueihed B., Zhou T., Nadeau-Vallee M., Hou X., Lavoie J.C., Mitchell G., Mammer O.A., Chentob S. G-protein–coupled receptor 91 and succinate are key contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2014. – V. 34, N 2. – P. 285-293.

Hamel, D. et al. G-protein-coupled receptor 91 and succinate are key contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery. Arterioscler Thromb Vasc Biol 34, 285–293 (2014).

He W., Miao F.J.P., Lin D.C.H., Schwandner R.T., Wang Z., Gao J., Chen J.L., Tian H., Ling L. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G- protein-coupled receptors // Nature. - 2004. – V. 429, N 6988. – P. 188–193.

Juranova J., Frankova J., Ulrichova J. The role of keratinocytes in inflammation. Journal of Applied Biomedicine 15, 169–179 (2017).

Ko S.H., Choi G.E., Oh J.Y., Lee H.J., Kim J.S., Chae C.W., Choi D., Han H.J. Succinate promotes stem cell migration through the GPR91-dependent regulation of DRP1-mediated mitochondrial fission. Scientific reports 7:12582, 1-4 (2017).

Konger R.L., Malaviya R., Pentland A.P. Growth regulation of primary human keratinocytes by prostaglandin E receptor EP2 and EP3 subtypes. Biochim. Biophys. Acta. 1401, 221–234 (1998).

Leon A., Buriani A., Dal-Toso R. et al. Mast cells synthesize, store and release nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 91, 3739 (1994).

Li, Y. H., Woo, S. H., Choi, D. H. & Cho, E.-H. Succinate causes α-SMA production through GPR91 activation in hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 463, 853–858 (2015).

Lynch S.E., Nixon J.C. Role of platelet-growth factor in wound healing: synergistic affects with growth factors. Proc Natl Acad Sci USA 84:7696 (1987).

Mills E., O’Neill L.A.J. Succinate: a metabolic signal in inflammation. Trends Cell Biol 24 (2014).

Nimni M.E. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials 18:1201 (1997).

Palazzo E., Marconi A., Truzzi F., Dallaqlio K., Petrachi T., Humbert P., Schnebert S., Perrier E., Dumas M., Pincelli C. Role of neurotrophins on dermal fibroblast survival and differentiation. J Cell Physiol 227(3):1017-1025 (2012).

Pierce G.F. et al. Stimulation of all epithelial elements during skin regeneration by keratinocyte growth factor. J Exp Med 179:831 (1994).

Pincelli C., Sevignani C., Manfredini R. et al. Expression and function of nerve growth factor and nerve growth factor receptor on cultured keratinocytes. J Invest Dermatol 103, 13. (1994).

Rubic T., Lametschwandtner G., Jost S., Hinteregger S., Kund J., Carballido-Perrig N., Schwarzler C., Junt T., Voshol H., Meingassner J.G. et al. Triggering the succinate receptor GPR91 on dendritic cells enhances immunity // Nat.Immunol. - 2008. – V. 9, N 11. – P. 1261–1269.

Santambrogio L., Benedetti M., Chao M.V. et al. Nerve growth factor production by lymphocytes. J Immunol 153, 4488 (1994).

Sapieha P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis // Blood. – 2012. – V 120, N 11. – P. 2182-2194.

Sapieha P., Sirinyan M., Hamel D., Zaniolo K., Joyal J.-S., Cho J.-H., Honoré J.-C., Kermorvant-Duchemin E., Varma D.R., Tremblay S. et al. The succinate receptor GPR91 in neurons has a major role in retinal angiogenesis // Nature Medicine. – 2008. – V. 14, N 10. – P. 1067-1076.

Suter M.M., Schulze K., Bergman W., Welle M., Roosje P., Muller E.J. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Vet. Dermatol. 20, 515–532 (2009).

Toma I., Kang J.J., Sipos A., Vargas S., Bansal E., Hanner F., Meer E., Peti-Peterdi J. Succinate receptor GPR91 provides a direct link between high glucose levels and rennin release in murine and rabbit kidney // J. Clin.Invest. – 2008. – V. 118, N 7. – P. 2526–2534.

Yasuda M, Yamasaki K, Ohtaki H. Stability of Complexes of Several Carboxylic Acids Formed with Bivalent Metals. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1960; 33(8): 1067–1070.

Zarubina I.V., Lukk M.V., Shabanov P.D. Antihypoxic and antioxidant effects of exogenous succinic acid and aminothiol succinate-containing antihypoxants. Bull Exp Biol Med 2012; 153(3): 336–9.